Sp1誘導(dǎo)miR-205表達(dá)促進(jìn)食管癌放療抵抗的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　食管癌是損害人類健康的主要惡性腫瘤之一,侵襲性高。在世界范圍內(nèi),發(fā)病率在全部腫瘤中為第8,在腫瘤關(guān)聯(lián)死亡中位于第6。我國(guó)是食管癌高發(fā)病區(qū),每年的新發(fā)病人數(shù)占全世界的一半以上。食管癌患者預(yù)后差,5年生存率為5％-45%。放射治療是食管癌治療的重要手段之一。然而,影響放療效果的因素很多,組織缺氧程度、谷胱甘肽含量、腫瘤對(duì)輻射效應(yīng)存在個(gè)體差異等均導(dǎo)致放療效果不如意,甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的放療抵抗性。放射抵抗是食管癌治療失敗的重要原因

2、。因此,研究放療抵抗的發(fā)生機(jī)制,有助于為食管癌的治療及預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略,這是目前食管癌綜合治療中亟待解決的熱點(diǎn)問題。
　　MicroRNAs(miRNA)是內(nèi)源性非編碼的單鏈小 RNAs分子,長(zhǎng)度約18-25個(gè)核苷酸。文獻(xiàn)報(bào)道射線可以引起組織或細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化,誘發(fā)腫瘤放療抵抗性的發(fā)生,但目前關(guān)于miRNA作用于腫瘤放療抵抗性的具體機(jī)制尚不透徹。我們的研究發(fā)現(xiàn) miR-205在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),而它與

3、食管癌放療的關(guān)系國(guó)內(nèi)外目前尚未有報(bào)道。在實(shí)驗(yàn)的前期,我們建立了三株食管癌細(xì)胞的放療抵抗株,對(duì)比miR-205在放療抵抗株與親本株中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示miR-205在三株放療抵抗株中的表達(dá)水平均顯著上調(diào),提示 miR-205參與了食管癌放療抵抗性的調(diào)控。因此我們從細(xì)胞、分子、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面探討 miR-205對(duì)食管癌的放療抵抗性作用與分子機(jī)制。
　　目的:
　　1、建立食管癌放療抵抗株,并檢驗(yàn)其與親本株的分子差異;
　　

4、2、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究miR-205對(duì)食管癌的放療抵抗性作用;
　　3、探討miR-205對(duì)食管癌放療抵抗性的分子機(jī)制;
　　方法:
　　1、分割劑量法構(gòu)建食管癌放療抵抗株;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)放療抵制株與親本株的放療抵抗性;流式細(xì)胞儀分析放療抵制株與親本株輻射下的凋亡率;Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)放療抵制株與親本株的分子差異。
　　2、Taqman qPCR檢測(cè)抵抗株與親本株miR-205的表達(dá)差異,同時(shí)檢測(cè)輻射

5、后早期不同時(shí)間點(diǎn) miR-205的變化;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)過表達(dá) miR-205或干擾miR-205對(duì)食管癌細(xì)胞放療抵抗性的影響;流式細(xì)胞儀分析過表達(dá)miR-205或干擾miR-205對(duì)食管癌細(xì)胞輻射下凋亡與周期的影響。
　　3、Taqman qPCR和 SYBR qPCR分別檢測(cè)細(xì)胞輻射后不同時(shí)間點(diǎn) miR-205和miR-205HG的表達(dá);生物信息學(xué)預(yù)測(cè)SP1是調(diào)控miR-205表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子;Taqman qPCR和SYB

6、R qPCR分別檢測(cè)干擾SP1后的SP1和miR-205表達(dá);構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,并檢測(cè)SP1作用于miR-205HG啟動(dòng)區(qū)的熒光素酶活性; ChIP普通PCR和ChIP qPCR檢測(cè)SP1與miR-205HG啟動(dòng)區(qū)的結(jié)合情況。
　　4、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PTEN可能是miR-205的直接靶點(diǎn),并用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和 Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證;流式細(xì)胞儀檢測(cè)PTEN與miR-205相互作用對(duì)食管癌細(xì)胞輻射下的凋亡影響

7、;Western Blot檢驗(yàn)miR-205表達(dá)變化對(duì)Akt通路的影響。
　　5、流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞;Taqman qPCR檢測(cè)miR-205的干擾效果;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-205促進(jìn)食管癌放療抵抗性;HE染色檢測(cè)瘤塊的壞死程度。
　　結(jié)果:
　　1、建立食管癌放療抵抗株,檢測(cè)其與親本株的差異
　　抵制株細(xì)胞多呈梭狀或紡錘狀,有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變趨勢(shì)。放療抵制株細(xì)胞輻射下的克隆形成能力強(qiáng)于親本株細(xì)胞。放療抵抗株細(xì)胞輻射

8、下的凋亡率低于親本株。放療抵抗株細(xì)胞的Akt信號(hào)通路被激活。
　　2、MiR-205促進(jìn)食管癌細(xì)胞的放療抵抗性
　　食管癌放療抵抗株中的 miR-205表達(dá)上調(diào),且輻射早期即可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞miR-205的表達(dá)增加。上調(diào)miR-205增強(qiáng)食管癌細(xì)胞輻射下的克隆形成能力,抑制食管癌細(xì)胞輻射下的凋亡,但對(duì)輻射下食管癌細(xì)胞的周期無影響。下調(diào) miR-205抑制食管癌細(xì)胞輻射下的克隆形成能力,增強(qiáng)輻射下食管癌細(xì)胞的凋亡,對(duì)輻射下食管

9、癌細(xì)胞的周期亦無影響。
　　3、SP1誘導(dǎo)miR-205表達(dá)調(diào)控食管癌放療抵抗的分子機(jī)制
　　食管癌細(xì)胞miR-205HG的轉(zhuǎn)錄本在輻射后不同時(shí)間點(diǎn)隨著miR-205的上調(diào)而增加,miR-205HG與 miR-205的表達(dá)水平正相關(guān),證實(shí) miR-205HG是 miR-205的轉(zhuǎn)錄前體。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-205HG的啟動(dòng)子區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子SP1的結(jié)合位點(diǎn),提示SP1可能是調(diào)控miR-205表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。下調(diào)SP1表達(dá)后,m

10、iR-205的表達(dá)也下調(diào),且能逆轉(zhuǎn)X射線輻照誘導(dǎo)的miR-205表達(dá)上調(diào)。X射線輻照和過表達(dá)SP1均能增加miR-205HG啟動(dòng)區(qū)熒光素酶報(bào)告基因的活性,而下調(diào)SP1能抑制X射線輻照誘導(dǎo)的 miR-205HG轉(zhuǎn)錄活性增加,證實(shí) X射線輻照是通過促進(jìn) SP1對(duì)miR-205HG的轉(zhuǎn)錄激活來增加miR-205的表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)X射線輻照能夠促進(jìn)SP1與miR-205HG啟動(dòng)區(qū)的結(jié)合。
　　4、MiR-205調(diào)控PTEN,激活A(yù)k

11、t通路,誘導(dǎo)放療抵抗的分子機(jī)制
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示PTEN是 miR-205作用的下游靶點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)表明miR-205可以顯著抑制野生型PTEN3’UTR報(bào)告基因活性,但不能抑制突變型PTEN3’UTR報(bào)告基因活性。Western Blot證實(shí)過表達(dá)miR-205或干擾miR-205可以下調(diào)或上調(diào)PTEN的蛋白表達(dá)。PTEN可以部分逆轉(zhuǎn)miR-205對(duì)食管癌細(xì)胞輻射下的凋亡抑制作用。過表達(dá)親本株細(xì)胞中的miR

12、-205顯著激活了Akt信號(hào)通路,干擾放療抵抗株細(xì)胞的miR-205表達(dá),顯著抑制了Akt信號(hào)通路。
　　5、MiR-205促進(jìn)食管癌放療抵抗性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞分選并檢測(cè)后得到穩(wěn)定干擾miR-205的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。抑制miR-205的表達(dá)能減弱食管癌的放療抵抗性。HE染色顯示輻射能誘導(dǎo)腫瘤壞死,抑制miR-205的表達(dá)能促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的腫瘤壞死發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　X射線輻照后能通過激活轉(zhuǎn)錄因子SP1,促進(jìn)SP