Fascin-Ser39促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲移動(dòng)的作用機(jī)制及Fascin新相互作用蛋白的鑒定.pdf

1、Fascin，一種肌動(dòng)蛋白捆綁蛋白，近年來，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到研究者的關(guān)注。有研究表明，在人類正常上皮組織，F(xiàn)ascin一般不表達(dá)或僅表達(dá)于基底層細(xì)胞。在人類的多種惡性腫瘤中，F(xiàn)ascin過表達(dá)，與癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者的預(yù)后差相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，Ser39是Fascin高度保守的磷酸化位點(diǎn)，位于肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合位點(diǎn)1。Ser39磷酸化抑制 Fascin捆綁肌動(dòng)蛋白絲成束。Fascin相互作用蛋白的鑒定是一重要科學(xué)問

2、題，將十分有助于深入揭示惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制。然而，迄今為止，關(guān)于Fascin相互作用蛋白鑒定的研究報(bào)道很少。鑒于此，在本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲移動(dòng)等系列研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上，本文擬一方面深入研究食管癌細(xì)胞中Fascin蛋白Ser39位點(diǎn)磷酸化修飾的功能，另一方面，嘗試從食管癌細(xì)胞中鑒定Fascin某種新的相互作用蛋白?；厩闆r見下。
　　首先，將fascin編碼區(qū)全長插入質(zhì)粒pEGFP，構(gòu)建表達(dá)載

3、體pEGFP-fascin，并進(jìn)一步利用 PCR重疊延伸法定點(diǎn)突變，構(gòu)建兩個(gè) fascin/Ser39位點(diǎn)突變的表達(dá)載體， pEGFP-fascin/S39A和pEGFP-fascin/S39D。
　　其次，將pEGFP-fascin、pEGFP-fascin/S39A和pEGFP-fascin/S39D等質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞KYSE150，檢測癌細(xì)胞的移動(dòng)與侵襲能力的變化，同時(shí)觀察F-actin微絲的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1

4、）與轉(zhuǎn)染空載體pEGFP相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-fascin，使野生型Fascin高表達(dá)，食管癌細(xì)胞KYSE150的移動(dòng)與侵襲能力明顯增強(qiáng)，F(xiàn)-actin微絲支撐的棘狀突起增多，F(xiàn)-actin微絲與GFP-Fascin之間共定位；2）與轉(zhuǎn)染 pEGFP-fascin相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-fascin/S39A，使突變型 Fascin/S39A高表達(dá)，食管癌細(xì)胞 KYSE150的移動(dòng)與侵襲能力進(jìn)一步增強(qiáng)，F(xiàn)-actin微絲支撐的棘狀突起變得

5、更多、更尖和更長，F(xiàn)-actin微絲與GFP-Fascin之間依然共定位；3）與轉(zhuǎn)染pEGFP-fascin相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-fascin/S39D，使突變型Fascin/S39D高表達(dá)，食管癌細(xì)胞KYSE150的移動(dòng)與侵襲能力明顯減弱，由F-actin微絲支撐的棘狀突起明顯變少而且短小，F(xiàn)-actin微絲與GFP-Fascin之間僅部分共定位。
　　再次，利用免疫共沉淀、SILAC標(biāo)記與蛋白質(zhì)譜，在食管癌細(xì)胞KYSE180與

6、TE3中，鑒定Fascin相互作用蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Annexin A2、GAPDH、Myosin-9、PCNA、Septin-2和Ubiquitin C等共21種蛋白，可能與Fascin存在著直接或間接的相互作用關(guān)系。
　　最后，用免疫共沉淀和免疫印跡等方法，結(jié)合他人文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)上述的Annexin A2、Myosin-9和PCNA等候選Fascin相互作用蛋白給予了初步鑒定。
　　總之，本文實(shí)驗(yàn)研究證明，在食管癌細(xì)胞中