抗Rab39A多克隆抗體的制備檢測(cè)及Rab39A相互作用蛋白的篩選鑒定.pdf

1、Rab/Ypt/Sec4家族是RaS超家族中重要的一類(lèi)小分子GTP酶,在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸途徑方面發(fā)揮重要的作用。Rab39是Rab家族中的新發(fā)現(xiàn)的蛋白,包含兩個(gè)亞型:Rab39A和Rab39B,兩者分別定位于11號(hào)染色體和X染色體上,CDS序列具有較高的相似性。關(guān)于Rab39功能,目前還沒(méi)有深入的研究報(bào)道。
　　 為了制備抗Rab39A抗體用于研究,分析了Rab39A氨基酸序列,選取Rab39A免疫原性強(qiáng)和特異性高的羧基端42

2、個(gè)氨基酸(176-217aa)作為目的片段。通過(guò)PCR擴(kuò)增Rab39A羧基端的42個(gè)氨基酸的DNA編碼序列,構(gòu)建了pGEX-4T-1-Rab39C42質(zhì)粒。誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得GST-Rab39C42融合蛋白,免疫健康新西蘭兔,制備了抗Rab39A的抗體。制備的抗體在免疫印跡中可以特異性地識(shí)別外源和內(nèi)源的Rab39A,在免疫熒光中能夠識(shí)別內(nèi)源Rab39A。
　　 酵母雙雜交是尋找與靶蛋白相互作用蛋白的一種非常有效的方法。為了研究R

3、ab39A蛋白的功能,采用酵母雙雜交的方法,以Rab39A作為誘餌蛋白,利用Gal4系統(tǒng)釣取文庫(kù)中與Rab39A相互作用的蛋白。首先構(gòu)建pGBKT7-Rab39A載體,將其轉(zhuǎn)入AH109酵母菌。在檢測(cè)其毒性和自激活能力后,與Y187文庫(kù)菌進(jìn)行雜交。最終通過(guò)DNA測(cè)序確定在文庫(kù)中釣取的基因序列。在NCBI中進(jìn)行Blast分析,獲得克隆對(duì)應(yīng)的蛋白信息。然后挑取感興趣的基因重新轉(zhuǎn)入Y187酵母菌中,與轉(zhuǎn)入pGBKT7-Rab39A的AH109

4、進(jìn)行雜交,同時(shí)與pGBKT7 vector載體雜交作為對(duì)照,驗(yàn)證酵母雙雜交結(jié)果。再通過(guò)免疫熒光和GST-pulldown實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的蛋白與Rab39A的相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功預(yù)測(cè)了Rab39A的特異性抗原表位,并制備了抗原。
　　 2.免疫新西蘭兔,成功制備了抗Rab39A的特異性抗體,用于Western Blot和免疫熒光檢測(cè)。
　　 3.通過(guò)酵母雙雜交獲得了一些與Rab39