2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、背景:
  食管癌是我國(guó)較常見的惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi),屬第六大最常見的癌癥,癌癥死亡的第五大原因,主要分為兩大亞型:食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC),西方國(guó)家食管癌以EAC為主,而 ESCC在發(fā)展中國(guó)家較為普遍。目前對(duì)食管癌的治療仍以手術(shù)切除,輔以放化療的方法。受檢測(cè)方法等因素限制,多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)

2、時(shí)已屬中晚期,傳統(tǒng)的治療方法不能有效延長(zhǎng)患者的生存期,因此從基因和分子水平探討食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制,顯得尤為必要和迫切。
  MicroRNAs(miRNAs)是一類大小約20-24 nt的非編碼微小RNA,在生物中廣泛存在,并通過與靶標(biāo)基因mRNA上的3'端非翻譯區(qū)(3' untranslational region,3'-UTR)種子區(qū)域特異結(jié)合對(duì)靶基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,或者維持靶基因的穩(wěn)定性。近年來(lái)的研究顯示,miRNA通過與靶

3、基因的3'-UTR結(jié)合從而抑制特定的癌基因或抑癌基因,其作用類似抑癌基因或癌基因,參與腫瘤細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)及上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,目前 miRNA在腫瘤中的研究己成為一個(gè)新熱點(diǎn)。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是21世紀(jì)的一個(gè)里程碑似的科學(xué)發(fā)現(xiàn)。
  多項(xiàng)研究證實(shí) miRNAs在食管癌中的重要性和潛在應(yīng)用前景,多個(gè)抑制或促進(jìn)食管癌進(jìn)程的miRNAs被發(fā)現(xiàn),如miR-21、miR

4、-205、miR-203、miR-145、let7、miR-196a等。miR-1207-5p位于染色體8q24,由非編碼基因PVT1產(chǎn)生,與其同家族的還有miR-1204、miR-1205、miR-1206和miR-1208,PVT1是多種類型癌癥的一個(gè)潛在的致癌基因。該家族的miR-1204和miR-1206均發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。在包括乳腺癌、胃癌和腸癌多種腫瘤以及干燥綜合征、慢性腎衰竭等疾病中發(fā)現(xiàn)miR-1207-5p異常

5、表達(dá)并與疾病的惡性程度密切相關(guān),然而它在食管癌中的表達(dá)和作用尚未有研究報(bào)道。本課題主要包括:1.探討miR-1207-5p在食管鱗癌組織及細(xì)胞中的表達(dá),以及與疾病的相關(guān)性;2.調(diào)控miR-1207-5p表達(dá)水平對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和EC-1的生物學(xué)影響;3.初步探討miR-1207-5p靶基因及抑制腫瘤的可能機(jī)制。研究目的在于探討miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響,以期為食管鱗癌的診斷和防治提供理論依據(jù)。
  

6、材料與方法:
  第一部分 miR-1207-5p在食管鱗癌組織中的異常表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性
  1、收集49例ESCC臨床標(biāo)本及其匹配的癌旁組織。
  2、取3例ESCC中心組織及其匹配癌旁組織行Agilent miRNA芯片檢測(cè),分析miRNA的差異性表達(dá),篩選出上調(diào)或下調(diào)的miRNA。
  3、TRIzol法提取組織總RNA并檢測(cè)RNA質(zhì)量;qRT-PCR法分別驗(yàn)證上調(diào)的miRNA3個(gè)(miR-21

7、-5p,miR-138和miR-196a-5p);下調(diào)的miRNA3個(gè)(miR-133a,miR-495和miR-1207-5p);
  4、根據(jù)miR-1207-5p在組織中的表達(dá)水平,分析miR-1207-5p表達(dá)水平與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腫瘤定位、性別和年齡等之間的關(guān)系。
  5、檢測(cè)5種鱗癌細(xì)胞株和正常食管上皮細(xì)胞中miR-1207-5p的表達(dá)水平。
  第二部分 miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)

8、胞生物學(xué)行為的影響
  1、合成miR-1207-5p模擬物(mimics)和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照(NC)后,通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鱗癌細(xì)胞株EC9706和EC-1。
  2、應(yīng)用CCK-8(Cell Counting Kit-8)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖變化。
  3、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲力。
  4、AnnexinV-FITC/PI法和Hoechst333

9、42/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡。PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
  5、合成經(jīng)修飾過的miR-1207-5p模擬物(agomir)和對(duì)應(yīng)的NC后,通過脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染鱗癌細(xì)胞 EC9706,接種裸鼠皮下,檢測(cè)miR-1207-5p在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
  第三部分 miR-1207-5p與STOML-2的靶向關(guān)系研究
  1、通過 TargetScan(www.targetscan.org)和

10、miRDB(www.mirdb.org)在線預(yù)測(cè)miR-1207-5p的靶基因,STOML-2(Stomatin-like protein2)為其潛在靶基因。
  2、檢測(cè)49例鱗癌中心組織及其匹配癌旁組織的STOML-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平,并與miR-1207-5p在組織中的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
  3、檢測(cè)5種鱗癌細(xì)胞中的STOML-2蛋白水平。
  4、通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因。將 STOM

11、L-23'-UTR的野生型(WT)和突變型(MT)序列插入 pmirGLO載體構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒 pmirGLO-STOML-2-3'-UTR-WT/MT;然后將其與 miR-1207-5p mimics或 NC共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞,分別檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性;以驗(yàn)證STOML-2是否為 miR-1207-5p的靶基因。
  5、將miR-1207-5p mimics或NC轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和EC-1

12、,WB檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)STOML-2蛋白表達(dá)情況。
  6、運(yùn)用小 RNA干擾技術(shù)降低鱗癌細(xì)胞中 STOML-2的表達(dá),同時(shí)構(gòu)建缺失3'-UTR的表達(dá)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-STOML-2上調(diào)鱗癌細(xì)胞中STOML-2的表達(dá),觀察其表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響;在細(xì)胞中利用表達(dá)載體pcDNA3.1-STOML-2上調(diào)STOML-2表達(dá),同時(shí)在細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-1207-5p mimics或 NC,觀察細(xì)胞增殖和侵襲的變化,并分析 S

13、TOML-2是否阻斷miR-1207-5p對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲力的抑制作用。
  7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行,數(shù)據(jù)以X±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)和ANOVA。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman分析,以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
  結(jié)果
  第一部分 miR-1207-5p在食管鱗癌組織中的異常表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性
  1、在檢測(cè)的3例鱗癌中心組織

14、中,芯片篩選出上調(diào)表達(dá)的miRNAs18個(gè),下調(diào)表達(dá)的miRNAs40個(gè)。
  2、經(jīng) qRT-PCR驗(yàn)證的6個(gè) miRNAs(miR-21-5p,miR-138,miR-196a-5p,miR-133a,miR-495和miR-1207-5p),表達(dá)均與芯片結(jié)果一致,其中miR-1207-5p為下調(diào)表達(dá)。
  3、49例食管鱗癌中心組織與其匹配癌旁組織中,81.6%(40/49)的鱗癌患者腫瘤組織中miR-1207-5p表

15、達(dá)水平較癌旁對(duì)照組織降低;差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);統(tǒng)計(jì)分析表明:miR-1207-5p表達(dá)水平下降與腫瘤分化程度有相關(guān)性(P<0.01);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期均有相關(guān)性(P<0.01)。但與腫瘤定位、性別和年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。
  4、5種鱗癌細(xì)胞中miR-1207-5p的水平較正常上皮細(xì)胞低(P<0.05)。
  第二部分 miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
  1、轉(zhuǎn)染 miR-1

16、207-5p mimics至食管鱗癌細(xì)胞株 EC9706和EC-1后,與對(duì)照組比較,EC9706細(xì)胞內(nèi)miR-1207-5p表達(dá)水平為34.20±3.86,EC-1細(xì)胞內(nèi)miR-1207-5p表達(dá)水平為18.81±3.17,表達(dá)水平上調(diào),差異顯著(P<0.01)
  2、與轉(zhuǎn)染miR-1207-5p NC組相比,miR-1207-5p mimics組細(xì)胞增殖率在48h后出現(xiàn)顯著抑制(P<0.05);
  3、轉(zhuǎn)染miR-12

17、07-5p mimics后,EC9706和EC-1兩種細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的數(shù)量分別為43.6±6.19和39.2±4.70,與對(duì)照組比較顯著降低(P<0.05)。
  4、在轉(zhuǎn)染 miR-1207-5p mimics的細(xì)胞中,EC9706細(xì)胞凋亡率為(11.33±1.01)%,NC組為(6.31±0.54)%,P<0.05;EC-1細(xì)胞凋亡率為(7.92±0.98)%,NC組為(4.88±0.53)%,P<0.05。
  5、B

18、lank、NC和miR-1207-5p mimics各轉(zhuǎn)染組中,G0/G1期細(xì)胞比例在EC9706細(xì)胞中分別為54.84%,54.15%和66.85%;在EC-1細(xì)胞中分別為56.29%,55.96%和67.14%,miR-1207-5p mimics組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高,差異具有顯著性(P<0.05);而 S期細(xì)胞比例減少(EC9706:29.44%,31.15%和21.60%;EC-1:31.21%,32.14%和17

19、.16%)。
  6、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示:miR-1207-5p agomir組腫瘤體積顯著低于 miR-1207-5p對(duì)照組腫瘤體積(P<0.05),并且腫瘤生長(zhǎng)速度減緩。
  第三部分 miR-1207-5p與STOML-2的靶向關(guān)系研究
  1、TargetScan和miRDB均預(yù)測(cè)STOML-2為miR-1207-5p的靶基因之一。
  2、檢測(cè)49例食管鱗癌中心組織與其匹配癌旁組織,發(fā)現(xiàn)STOML-2 m

20、RNA和蛋白在癌組織中均表達(dá)升高,而miR-1207-5p在癌組織中表達(dá)水平降低,相關(guān)性分析表明:miR-1207-5p和STOML-2在組織中存在負(fù)相關(guān)(R2=0.73)。
  3、5種鱗癌細(xì)胞株中STOML-2蛋白表達(dá)高于正常食管上皮細(xì)胞。
  4、共轉(zhuǎn)染 miR-1207-5p mimics和pmirGLO-STOML-2-3'-UTR-WT重組載體時(shí),細(xì)胞螢光素酶基因活性顯著降低(P<0.01);而同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-1

21、207-5p mimics和pmirGLO-STOML-2-3'-UTR-MT重組載體時(shí),細(xì)胞螢光素酶基因活性無(wú)顯著變化。
  5、在EC9706和EC-1細(xì)胞中,WB結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-1207-5p mimics的細(xì)胞中,STOML-2蛋白表達(dá)水平顯著抑制(P<0.05);提示miR-1207-5p mimics可以與STOML-2的3'-UTR結(jié)合并抑制其表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證STOML-2為miR-1207-5p

22、的靶基因。
  6、在EC9706和EC-1細(xì)胞中,運(yùn)用RNAi技術(shù)降低STOML-2的表達(dá)后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖和侵襲力顯著降低(P<0.05)。
  7、在EC9706和EC-1細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染無(wú)3'-UTR的pcDNA3.1-STOML-2表達(dá)載體組,STOML-2蛋白表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染組比較,顯著升高。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明:與對(duì)照組比較,該組細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與共轉(zhuǎn)染miR-

23、1207-5p mimics和無(wú)3'-UTR的pcDNA3.1-STOML-2組比較,該轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性改變(P>0.05)。結(jié)果顯示: miR-1207-5p是通過結(jié)合STOML-2基因的3'-UTR而調(diào)控其表達(dá)的;上調(diào)STOML-2表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn) miR-1207-5p對(duì)鱗癌細(xì)胞侵襲的抑制作用。
  結(jié)論:
  1、食管鱗癌組織中共篩選獲得18個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNAs,40個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNAs。

24、miR-1207-5p在食管鱗癌組織中低表達(dá),并且miR-1207-5p的表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)程和TNM分期相關(guān)。
  2、上調(diào)miR-1207-5p表達(dá)能夠?qū)?xì)胞增殖和侵襲起抑制作用,而對(duì)細(xì)胞的凋亡則起促進(jìn)作用;miR-1207-5p過表達(dá)能夠減緩腫瘤生長(zhǎng)速度,縮小腫瘤體積。
  3、STOML-2為 miR-1207-5p的靶基因,miR-1207-5p可通過結(jié)合STOML-2的3'-UTR而調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)

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