食管鱗癌中Survivin對NF-κB p65調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的:食管癌位于世界常見惡性腫瘤的第四位，其病死率高，預(yù)后差，患者總體的5年生存率僅為10％左右，已嚴(yán)重危害人民的生命健康。中國是食管癌高發(fā)的國家之一，全世界每年新確診的食管癌中有近一半發(fā)生在中國。在中國，食管鱗癌是食管癌最常見的病理類型。近年來，雖然食管鱗癌的治療水平得到了較大幅度的提高，但是患者遠(yuǎn)期生存仍不樂觀。研究表明，早期診斷和治療可以改善食管鱗癌患者的預(yù)后，鑒于一些分子標(biāo)記物在腫瘤發(fā)生之前就已經(jīng)發(fā)生了變化，所以通過檢測這些分子

2、標(biāo)記物將有助于食管鱗癌的早期診斷和治療。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，它通過抑制細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的分期和患者的預(yù)后有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族，特別是NF-κB p65(RelA)亞基可通過調(diào)控多種基因的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、凋亡和分化，在腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制食管鱗癌細(xì)胞中Survivin的表達(dá)，會導(dǎo)致磷酸化NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平降低，提示在食管鱗癌中Su

3、rvivin對NF-κB p65的表達(dá)可能具有調(diào)控作用。但是，目前對于Survivin調(diào)控NF-κB p65表達(dá)的具體機(jī)制及作用位點(diǎn)尚不清楚。因此，本研究使用YM155、LV3-Survivin shRNA重組質(zhì)粒下調(diào)Survivin的表達(dá)，使用GV142-Survivin過表達(dá)重組質(zhì)粒上調(diào)Survivin的表達(dá)，通過對NF-κB p65及其上游基因IKKα、IKKβ的表達(dá)進(jìn)行檢測，來探討Survivin是否通過調(diào)控IKKα、IKKβ的

4、表達(dá)，影響NF-κB p65的活化;最后對Survivin調(diào)控NF-κB p65表達(dá)的作用位點(diǎn)，以及調(diào)控Survivin表達(dá)對細(xì)胞生物行為的影響進(jìn)行研究。
　　方法:
　　1）人食管鱗癌ECA109和KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)，使用不同濃度的Survivin抑制劑YM155作用于細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為空白對照組。48h后收集細(xì)胞，使用臺盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，評估YM155對細(xì)胞存活的影響。并在48h后收集細(xì)胞提

5、取總RNA和蛋白，使用RT-qPCR以及Western blotting對Survivin、NF-κB p65及其上游基因IKKα、IKKβ的表達(dá)進(jìn)行檢測，驗(yàn)證Survivin是否通過調(diào)控IKKα、IKKβ的表達(dá)，影響NF-κB p65的活化;
　　2）人食管鱗癌ECA109和KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建LV3-Survivin shRNA，LV3-control重組質(zhì)粒。LV3-Survivin shRNA重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，

6、構(gòu)建Survivin低表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞組，LV3-control重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照，完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為空白對照組。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞提取總RNA和蛋白，使用RT-qPCR以及Western blotting檢測Survivin的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。并檢測NF-κB p65及其上游基因IKKα、IKKβ的表達(dá)，驗(yàn)證Survivin是否通過調(diào)控IKKα、IKKβ的表達(dá)，影響NF-κB p65的活化。并使用流式細(xì)胞儀對細(xì)

7、胞的周期和凋亡進(jìn)行檢測，評估下調(diào)Survivin表達(dá)對細(xì)胞周期和凋亡的影響;
　　3）人食管鱗癌ECA109和KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建GV142-Survivin過表達(dá)重組質(zhì)粒。GV142-Survivin過表達(dá)重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建Survivin過表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞組，GV142空白質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照，完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞作為空白對照組。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞提取總RNA和蛋白，使用RT-qPCR以及Wester

8、n blotting檢測Survivin的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。并檢測NF-κB p65及其上游基因IKKα、IKKβ的表達(dá)，驗(yàn)證Survivin是否通過調(diào)控IKKα、IKKβ的表達(dá)，影響NF-κB p65的活化。并使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的周期和凋亡進(jìn)行檢測，評估上調(diào)Survivin表達(dá)對細(xì)胞周期和凋亡的影響;
　　4）染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn):為了證實(shí)Survivin蛋白是否通過與IKKα和/或IKKβ啟動子區(qū)的直接或間接結(jié)合，通過調(diào)控

9、IKKα和/或IKKβ啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，影響NF-κB p65的活化。將人食管鱗癌ECA109和KYSE150細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染GV142-Survivin過表達(dá)重組質(zhì)粒，使用Survivin特異性抗體免疫沉淀與Survivin蛋白結(jié)合的DNA片段，并使用IKKα和IKKβ啟動子區(qū)特異性引物對免疫沉淀的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增、鑒定;
　　5）雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn):人食管鱗癌細(xì)胞ECA109和KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建并轉(zhuǎn)染IKKβ

10、啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-IKKβ promoter，并同時共轉(zhuǎn)染pRL-TK質(zhì)粒和/或GV142-Survivin過表達(dá)重組質(zhì)粒，以評估Survivin對IKKβ啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1）Survivin的特異性抑制劑YM155作用于ECA109和KYSE150細(xì)胞可以抑制細(xì)胞存活，并下調(diào)NF-κB p65及其上游基因IKKα和IKKβ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，下調(diào)磷酸化的NF-κBp65及其

11、上游基因IKKα和IKKβ在蛋白水平的表達(dá);
　　2）瞬時轉(zhuǎn)染LV3-Survivin shRNA重組質(zhì)?？梢韵抡{(diào)ECA109和KYSE150細(xì)胞中Survivin在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)。Survivin的表達(dá)下調(diào)同時伴隨有NF-κB p65和其上游基因IKKα，IKKβ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)下調(diào)，以及磷酸化的NF-κB p65和其上游基因IKKα，IKKβ在蛋白水平的表達(dá)下調(diào)。在ECA109和KYSE150細(xì)胞中下調(diào)Survivin的

12、表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期;
　　3）瞬時轉(zhuǎn)染GV142-Survivin過表達(dá)重組質(zhì)?？梢陨险{(diào)ECA109和KYSE150細(xì)胞中Survivin在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)。Survivin的表達(dá)上調(diào)同時伴隨有NF-κB p65和其上游基因IKKα，IKKβ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)上調(diào)，以及磷酸化NF-κB p65和其上游基因IKKα，IKKβ在蛋白水平的表達(dá)上調(diào)。在ECA109和KYSE150細(xì)胞中上調(diào)Surviv

13、in的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期的G2/M期縮短;
　　4）染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，在ECA109細(xì)胞中，Survivin蛋白可以直接或間接與IKKβ啟動子的0至-700bp片段結(jié)合;
　　5）雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在ECA109細(xì)胞中，Survivin可以上調(diào)IKKβ啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論:
　　1）在食管鱗癌ECA109、KYSE150細(xì)胞中，通過抑制Survivin的表達(dá)，會使N

14、F-κ Bp65以及其上游基因IKKα，IKKβ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)發(fā)生下調(diào)，并抑制NF-κBp65在蛋白水平的活化;通過上調(diào)Survivin的表達(dá)，會使NF-κBp65以及其上游基因IKKα，IKKβ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，并促進(jìn)NF-κBp65在蛋白水平的活化;
　　2）在食管鱗癌ECA109細(xì)胞中，Survivin能與NF-κB p65上游基因IKKβ的啟動子0至-700區(qū)域發(fā)生直接或間接結(jié)合;
　　3）Survivin