Meloxicam通過COX-2依賴及非依賴途徑發(fā)揮其抗肝細(xì)胞肝癌機(jī)理的研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞肝癌(Hepato cellularcar cinoma,HCC)在男性癌癥死亡率中居于第二位，肝癌患者的5年的生存率只有11％，HCC的致病因素主要包括慢性病毒性肝炎、長期過量飲酒、肝硬化、食用含有黃曲霉素B1或者亞硝胺的食物等，其中慢性病毒性肝炎及長期過量飲酒導(dǎo)致肝硬化并進(jìn)一步發(fā)展成為肝癌被認(rèn)為是肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的主要因素。早期的肝癌患者并無明顯的臨床癥狀加之診療條件及醫(yī)療技術(shù)的限制，肝癌患者在發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于病程的中晚期

2、，僅約1/3患者有手術(shù)切除的機(jī)會，并且多數(shù)肝癌患者在局部切除術(shù)后往往伴有無法避免的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，預(yù)后效果差;HCC的局部治療（肝癌射頻消融治療、肝動脈介入化療栓塞及局部酒精治療等）只能暫時緩解肝癌患者的臨床癥狀，對延長患者的生存期及改善預(yù)后并無明顯作用;肝移植因其高昂的費(fèi)用及供體來源的限制，無法在中晚期肝癌患者中得到廣泛應(yīng)用;肝癌易產(chǎn)生化療耐受，對放療治療亦缺乏敏感性;索拉菲尼(sorafenib)作為一種多蛋白激酶抑制劑，是目前公認(rèn)的對肝

3、癌患者治療有效的分子靶向藥物，其具有抗血管生成和促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的雙重作用，在Ⅲ期大型臨床試驗中發(fā)現(xiàn)其延長肝癌患者的中位生存期可達(dá)2-3個月，但因其高昂的價格及藥物耐藥性的產(chǎn)生，在臨床上尚未無法得到廣泛應(yīng)用。因此，尋找肝癌治療的新方法及新的靶點蛋白是目前肝癌治療研究中的熱點。
　　環(huán)氧合酶-2（cyclo oxygenase-2，COX-2）過表達(dá)于多種腫瘤組織內(nèi)，是前列腺素合成中的限速酶，可調(diào)控花生四烯酸到前列腺素的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而發(fā)

4、揮其生物學(xué)活性。COX-2可影響到腫瘤生長的各個方面，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及耐藥基因的表達(dá)等，COX-2高表達(dá)的腫瘤患者對藥物治療的反應(yīng)更低，患者預(yù)后更差。研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織、正常肝組織比較，COX-2在肝癌組織中的表達(dá)明顯增高，COX-2高表達(dá)的肝癌患者其預(yù)后更差，提示COX-2蛋白可能為肝癌治療中潛在的靶點蛋白。美洛昔康（meloxicam）是COX-2的特異性抑制劑，其可有效抑制COX-2的蛋白活性，我們前期的研究結(jié)果

5、發(fā)現(xiàn)，meloxicam可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但其分子調(diào)控機(jī)制尚缺乏相應(yīng)的研究。前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)是在COX-2過表達(dá)的腫瘤中受COX-2調(diào)控合成的含量最高的前列腺素，PGE2可通過與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合（如PGE2受體EP2等），發(fā)揮其生物活性。細(xì)胞自噬是細(xì)胞的一種自我消化過程，由于其可誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡，亦稱為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡;因細(xì)胞類型及所受外界刺激的差異，

6、細(xì)胞自噬亦可拮抗藥物對腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，維持腫瘤細(xì)胞的生存，細(xì)胞自噬的激活被認(rèn)為是細(xì)胞生存過程中起調(diào)控作用的雙刃劍。腫瘤細(xì)胞的自噬與凋亡之間存在多節(jié)點，多層面的交叉調(diào)控，探討自噬與凋亡間的共調(diào)控蛋白，凋亡與自噬之間的相互調(diào)控機(jī)制是目前研究自噬與凋亡關(guān)系的熱點。然而，細(xì)胞自噬的激活在meloxicam調(diào)控的肝癌細(xì)胞生長中的關(guān)系及作用尚需進(jìn)一步探討。
　　本研究中，我們設(shè)計實驗探討meloxicam抗肝癌的分子機(jī)制，研究自噬與凋亡

7、在meloxicam介導(dǎo)的肝癌的治療中的相互調(diào)控作用，并對相關(guān)的分子機(jī)制研究，從而為meloxicam在臨床的應(yīng)用提供實驗依據(jù)和聯(lián)合用藥的理論基礎(chǔ)。方法:選取5種最常見的肝癌細(xì)胞系—SMMC-7402、Bel-7402、HepG2、
　　SMMC-7721及Huh7，應(yīng)用Westernblot篩選出COX-2高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株，并檢測PGE2受體EP2在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)。為進(jìn)一步篩選出對meloxicam治療敏感的肝癌細(xì)胞株，應(yīng)

8、用CCK-8細(xì)胞活力實驗檢測COX-2高表達(dá)肝癌細(xì)胞株對meloxicam治療的敏感性。選擇對meloxicam治療敏感的肝癌細(xì)胞株，應(yīng)用細(xì)胞遷移、侵襲、粘附及克隆形成實驗，檢測meloxicam對所選肝癌細(xì)胞株遷移、侵襲、粘附及克隆形成能力的影響。為進(jìn)一步探討meloxicam引起肝癌細(xì)胞遷移、侵襲及克隆形成能力的調(diào)控機(jī)制，應(yīng)用Westernblot檢測meloxicam、PGE2及rh-MMP-2對與肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、粘附及克隆形

9、成密切相關(guān)蛋白E-鈣粘素(E-cadherin)的影響，檢測meloxicam對與E-鈣粘素(E-cadherin)降解密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶1/2(matrix metallo proteinase1/2，MMP-1/2)表達(dá)的調(diào)控作用;通過酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA(Enzyme Linked Immuno sorbent Assay)檢測meloxicam或（和）PGE2對E-cadherin的降解產(chǎn)物可溶性鈣粘素(solubl

10、e E-cadherin，s E-cadherin)的影響，檢測PGE2及可溶性基質(zhì)金屬蛋白酶-2（recombinant human MMP-2protein，rh-MMP-2）對E-cadherin的降解產(chǎn)物sE-cadherin的影響;通過real-timeRT-PCR，RT-PCR檢測meloxicam、PGE2及rh-MMP-2對E-cadherinmRNA表達(dá)的影響。
　　腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲與凋亡能力的改變是細(xì)胞生存

11、過程中的共同事件，共同調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的活性，為進(jìn)一步探討遷移、侵襲及凋亡蛋白之間的相互關(guān)系，應(yīng)用Westernblot檢測meloxicam、PGE2及rh-MMP-2對凋亡信號通路PI3K/AKT中AKT蛋白磷酸化激活的影響。流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測肝癌細(xì)胞株HepG2，SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)meloxicam，meloxicam+PGE2、meloxicam+rh-mmp-2處理后，與對照組比較細(xì)胞凋亡率的變化。

12、為進(jìn)一步檢測內(nèi)源性及外源性凋亡信號蛋白在meloxicam介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，應(yīng)用Westernblot檢測meloxicam對內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax，Bcl-xl，mcl-1及survivin蛋白表達(dá)的影響;Westernblot檢測meloxicam，PGE2及AKT激活的特異性抑制劑MK-2206對凋亡蛋白survivin、mcl-1、Bax的調(diào)控作用;Westernblot檢測meloxicam和（及）

13、PGE2對外源性凋亡通路中關(guān)鍵蛋白Fas-L、Fas蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　　細(xì)胞自噬的激活是（腫瘤）細(xì)胞拮抗藥物治療及外界不良刺激的的一種自我保護(hù)機(jī)制。為進(jìn)一步探討自噬在meloxicam治療肝細(xì)胞肝癌中的作用，分別通過Westernblot蛋白分析、吖啶橙(acridine orange，AO)及單丹磺酰尸胺(mono dansyl cadaverine，MDC)熒光染色檢測細(xì)胞自噬激活的標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ、自噬小體、自噬溶酶體

14、的形成，探討meloxicam對肝癌細(xì)胞自噬激活的影響。分別應(yīng)用細(xì)胞自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）、氯喹(chloro quine，CQ)抑制meloxicam誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬激活后，流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞自噬在meloxicam介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中的作用。應(yīng)用Westernblot進(jìn)一步檢測細(xì)胞自噬對受meloxicam調(diào)控的凋亡相關(guān)蛋白Bax，mcl-1，sur

15、vivin及Fas-L表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:Westemblot蛋白檢測結(jié)果示:COX-2蛋白在肝癌細(xì)胞系Bel-7402，SMMC-7721及HepG2細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，而在肝癌細(xì)胞系SMMC-7402、Huh7中呈低表達(dá)狀態(tài)。選取COX-2高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株Bel-7402，SMMC-7721及HepG2，經(jīng)CCK-8細(xì)胞活力檢測發(fā)現(xiàn)在COX-2高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株HepG2，Bel-7402及SMMC-7721中，melo

16、xicam在濃度為80μM時對HepG2，SMMC-7721及Bel-7402細(xì)胞活力具有最強(qiáng)的抑制作用，且敏感性依次為HepG2＞SMMC-7721＞Bel-7402。PGE2的受體EP2蛋白在SMMC-7402、Bel-7402、HepG2、SMMC-7721、Huh7細(xì)胞系中均有表達(dá)，且在肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721中表達(dá)量最高。肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721細(xì)胞及meloxicam在濃度為80μM，被選擇用

17、于后續(xù)實驗研究。
　　細(xì)胞侵襲、遷移、粘附及克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，經(jīng)meloxicam處理的肝癌細(xì)胞株(HepG2、SMMC-7721)，細(xì)胞的遷移、侵襲、粘附能力明顯降低，克隆實驗中集落形成數(shù)顯著減少。Westernblot蛋白檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞經(jīng)meloxicam(80μM)處理后，細(xì)胞間粘附蛋白E-cadherin表達(dá)增多，細(xì)胞上層培養(yǎng)液中sE-cadherin濃度降低，而sE-cadherin是E-cadherin

18、胞外域降解后的可溶性的蛋白片段(80KD)，表明meloxicam可能是通過調(diào)控E-cadherin降解相關(guān)的蛋白酶的表達(dá)/活性來實現(xiàn)對E-cadherin的調(diào)控，繼而對細(xì)胞的遷移、侵襲、粘附及克隆形成能力進(jìn)行調(diào)控。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)meloxicam可抑制MMP-2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，而加入PGE2后，meloxicam對MMP-2的抑制作用失，表明meloxicam主要是通過COX-2依賴的途徑實現(xiàn)對MMP-2蛋白表達(dá)的調(diào)控。Rea

19、ltimeRT-PCR、標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR檢測meloxicam對MMP-2mRNA調(diào)控，其檢測結(jié)果與meloxicam對MMP-2蛋白的調(diào)控一致，表明meloxicam主要在轉(zhuǎn)錄水平，通過COX-2依賴的途徑對MMP-2蛋白表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控;melxociam亦可以通過COX-2依賴的途徑，在轉(zhuǎn)錄水平對E-cadherin的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在含有meloxicam的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入rh-mmp-2后發(fā)現(xiàn)，meloxicam對E-cadh

20、erin表達(dá)的正調(diào)控作用消失，表明meloxicam在蛋白水平對E-cadherin表達(dá)的調(diào)控，亦是通過COX-2依賴的途徑來實現(xiàn)的。
　　AKT蛋白激酶(ProteinKinaseB，PKB)的磷酸化激活與否是細(xì)胞凋亡過程中的重要事件，細(xì)胞的遷移、侵襲等行為與細(xì)胞凋亡的發(fā)生為非獨立的、交叉重疊的過程，AKT蛋白可能為此過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。Westernblot蛋白檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)meloxicam處理72小時的肝癌細(xì)胞，AKT蛋白的

21、磷酸化激活受到明顯抑制;而在meloxicam處理的肝癌細(xì)胞中，分別加入PGE2及rh-MMP-2后，發(fā)現(xiàn)PGE2及rh-MMP-2均可拮抗meloxicam對AKT激活的抑制作用，而rh-MMP-2可增強(qiáng)對AKT的激活具有正調(diào)控作用的sE-cadherin在細(xì)胞上清液中的濃度，表明meloxicam對AKT蛋白激活的調(diào)控是通過COX-2/PGE2/E-cadherin的途徑來實現(xiàn)的。流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法凋亡檢測發(fā)現(xiàn)P

22、GE2，rh-MMP-2均可拮抗meloxicam對肝癌細(xì)胞的促凋亡作用。Westernblot蛋白檢測示，meloxicam可增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax，F(xiàn)as-L表達(dá)，降低抗凋亡蛋白mcl-1，survivin的表達(dá)，而對抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL的表達(dá)無明顯調(diào)控作用。通過加入AKT蛋白激酶激活的特異性抑制劑MK-2206、COX-2蛋白激酶活性產(chǎn)物PGE2發(fā)現(xiàn)，meloxicam對抗凋亡蛋白mcl-1，survivin的調(diào)控主要

23、是通過對AKT激活的抑制來實現(xiàn)的;meloxicam對促凋亡蛋白Bax，F(xiàn)as-L的表達(dá)調(diào)控是通過COX-2/AKT非依賴的途徑來實現(xiàn)的。
　　吖啶橙(AO)，單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色及Westernblot蛋白分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)meloxicam處理72小時后，肝癌細(xì)胞中自噬小體及自噬溶酶體明顯增多，細(xì)胞自噬激活的標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)，表明meloxicam誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞自噬的激活;應(yīng)用細(xì)胞自噬的特異性抑制劑3-MA后，

24、肝癌細(xì)胞中自噬溶酶體、自噬小體顯著減少，細(xì)胞自噬激活標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)降低，meloxicam誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬受到有效抑制。為進(jìn)一步檢測細(xì)胞自噬在meloxicam誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中的作用，AnnexinV/PI雙染法流式細(xì)胞技術(shù)測凋亡發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬特異性抑制劑3-MA/CQ單獨應(yīng)用時對肝癌細(xì)胞凋亡并無明顯作用，meloxicam與細(xì)胞自噬激活抑制劑3-MA/CQ聯(lián)合應(yīng)用組中，細(xì)胞凋亡率顯著增高，表明細(xì)胞自噬激活在meloxicam

25、誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中為拮抗因素。Westernblot蛋白檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬激活后可通過將meloxicam誘導(dǎo)生成的Bax蛋白吞噬，拮抗meloxicam對肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，此過程是通過COX-2非依賴的機(jī)制來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論:
　　1.Meloxicam通過COX-2/PGE2依賴的機(jī)制抑制了肝癌細(xì)胞中MMP-2表達(dá)，抑制了其介導(dǎo)的E-cadherin降解，降低了sE-cadherin的生成;
　　2.

26、sE-cadherin可通過HER/IGF-1途徑，促進(jìn)AKT蛋白的磷酸化激活，繼而調(diào)控肝癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白mcl-1和survivin表達(dá);
　　3.Meloxicam通過COX-2非依賴的機(jī)制引起了肝癌細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax，F(xiàn)as-L表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡;
　　4.Meloxicam誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可通過吞噬、降解促凋亡蛋白Bax來發(fā)揮其拮抗肝癌細(xì)胞凋亡的作用。
　　意義:
　　1.在肝細(xì)胞肝癌中