版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)約占肺癌的80%-85%,其惡性程度高、預(yù)后差,死亡率高居惡性腫瘤之首,是嚴(yán)重影響人類健康的重大疾病。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌臨床治療失敗的重要原因,抑制轉(zhuǎn)移是延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者生存時(shí)間的關(guān)鍵,也是非小細(xì)胞肺癌研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)是指腫瘤細(xì)胞在各種炎癥因子、細(xì)胞
2、因子的刺激下失去極性與細(xì)胞間連接,同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞表型,運(yùn)動(dòng)和遷移能力增強(qiáng)的現(xiàn)象,是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵事件。已有研究顯示環(huán)氧合酶2(Cox-2)可能參與了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)等誘導(dǎo)的EMT過程;而Cox-2的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),提示Cox-2抑制劑可能為非小細(xì)胞肺癌抗轉(zhuǎn)移治療提供了契機(jī)?;谏鲜稣J(rèn)識(shí),已有相當(dāng)多的臨床研究中將選擇性Cox-2抑制劑如Celecoxib等作為輔助用藥用于非小細(xì)胞肺癌的臨床
3、治療。然而,值得關(guān)注的是,Celecoxib與表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體抑制劑合用并未使非小細(xì)胞肺癌患者取得臨床獲益,提示有必要對(duì)Cox-2抑制劑在EMT及腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)行更深入系統(tǒng)地研究,為非小細(xì)胞肺癌的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
針對(duì)上述關(guān)鍵科學(xué)問題,本研究以廣泛使用的Cox-2選擇性抑制劑Celecoxib和Etodolac為研究對(duì)象,探討二者對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌EMT過程的影響及其分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Celecox
4、ib能時(shí)間及濃度依賴地促進(jìn)A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT,表現(xiàn)為EMT的分子標(biāo)志E-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平變化;細(xì)胞形態(tài)的改變;以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的增強(qiáng)。我們?cè)贑ox-2不表達(dá)的MCF-7細(xì)胞上觀察到相似的效應(yīng),提示Celecoxib促進(jìn)EMT的效應(yīng)不依賴于其對(duì)Cox-2的抑制作用。另外,與已有報(bào)道一致,Etodolac能夠抑制EMT的發(fā)生,提示Cox-2抑制劑對(duì)EMT的影響有一定的復(fù)雜性,可能與藥物的結(jié)構(gòu)密
5、切相關(guān)。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Celecoxib促進(jìn)EMT發(fā)生的作用與經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號(hào)通路無關(guān)。Celecoxib同時(shí)激活MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路,而其促進(jìn)EMT的作用主要通過MEK/ERK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Cox-2抑制劑Celecoxib能激活MER/ERK信號(hào)通路,促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EMT發(fā)生,且該作用不依賴于其對(duì)Cox-2的抑制作用。不同結(jié)構(gòu)的Cox-2抑制劑其作用具有很大的差
6、異性。上述發(fā)現(xiàn)為重新審視Cox-2抑制劑輔助非小細(xì)胞肺癌化療的臨床治療策略提供了重要的理論依據(jù),提示Cox-2抑制劑輔助治療惡性腫瘤的臨床研究有增加患者轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),需要非常慎重。
第一部分,Celecoxib促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT
目的:
以TGF-β1誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞,建立EMT體外研究模型。并給予不同劑量的Celecoxib,初步探討Celecoxib對(duì)A549細(xì)胞EMT過程的影響。
7、
方法:
1、以1 ng/ml的TGF-β1在無血清的培養(yǎng)條件下刺激A549細(xì)胞72 h,并根據(jù)Celecoxib的血藥濃度峰值選擇不同劑量的Celecoxib(2,4,6μ M),與1 ng/ml的TGF-β1合用或者單獨(dú)作用于A549細(xì)胞,通過western blot的方法檢測(cè)E-cad、vimentin的表達(dá)情況,研究Celecoxib對(duì)EMT效應(yīng)的影響是否具有濃度梯度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳的Celecox
8、ib劑量,與1 ng/ml的TGF-β1合用或者單獨(dú)作用于A549細(xì)胞24-72 h,通過western blot的方法檢測(cè)E-cad、vimentin的表達(dá)情況,研究Celecoxib對(duì)EMT的影響是否具有時(shí)間梯度。
2、上述方法的結(jié)果選擇Celecoxib的最佳使用劑量與應(yīng)用時(shí)間,通過免疫熒光的方法檢測(cè)A549細(xì)胞表面E-cad、vimentin的表達(dá)情況。
3、以Celecoxib的最佳使用劑量作用于A549細(xì)
9、胞,通過transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究Celecoxib能否影響A549細(xì)胞的遷移能力。
結(jié)果:
1、1 ng/ml的TGF-β1作用于A549細(xì)胞72小時(shí),E-cad表達(dá)下降,vimentin表達(dá)增加,細(xì)胞由上皮樣向梭形的間質(zhì)細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變。2-6μ M的Celecoxib與TGF-β1合用后,TGF-β1所致的E-cad下降及vimentin增加被加劇;同時(shí),Celecoxib本身就可以導(dǎo)致A549細(xì)胞E-cad表達(dá)
10、下降,vimentin表達(dá)增加。且隨著劑量增加或者作用時(shí)間延長(zhǎng),Celecoxib導(dǎo)致的EMT相關(guān)標(biāo)志物變化更加明顯。然而,單獨(dú)應(yīng)用Celecoxib,A549細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化。
2、免疫熒光結(jié)果顯示Celecoxib導(dǎo)致的A549細(xì)胞E-cad下降及vimentin表達(dá)增加,隨著用藥劑量的加大而加強(qiáng)。
3、4μM或者6μM的Celecoxib作用于A549細(xì)胞18 h后,細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)。
11、結(jié)論:
實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Celecoxib通過非TGF-β1依賴性途徑促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT,增強(qiáng)A549細(xì)胞的遷移能力。
第二部分:Celecoxib誘發(fā)的EMT不依賴于其對(duì)Cox-2的抑制作用
目的:
探討Celecoxib誘發(fā)的EMT效應(yīng)是否與Cox-2蛋白有關(guān)。第一、以不表達(dá)Cox-2蛋白的MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象,以不同劑量的Celecoxib刺激MCF-7細(xì)胞,觀察MCF-7細(xì)胞EM
12、T相關(guān)表型變化。第二、研究另一種選擇性Cox-2蛋白抑制劑依托度酸(Etodolac)對(duì)A549細(xì)胞EMT相關(guān)表型的影響。
方法:
1、通過western blot檢測(cè)A549細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞Cox-2蛋白的表達(dá)情況。
2、以無血清的DMEM培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞,將不同劑量的Celecoxib(2,4,6μ M)作用于MCF-7細(xì)胞24-48 h,通過western blot的方法檢測(cè)E-cad、vime
13、ntin的表達(dá)情況。
3、以1 ng/ml的TGF-β1在無血清的培養(yǎng)條件下刺激A549細(xì)胞72 h,并加入不同劑量的Etodolac(5,10μ M),通過western blot的方法檢測(cè)E-cad、vimentin的表達(dá)情況。單獨(dú)應(yīng)用5-10μM的Etodolac刺激A549細(xì)胞,72 h后通過western blot的方法檢測(cè)E-cad、vimentin的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1、A549細(xì)胞表達(dá)Co
14、x-2蛋白,但MCF-7細(xì)胞不表達(dá)Cox-2蛋白。
2、2-6μM的Celecoxib作用于MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后,MCF-7細(xì)胞的E-cad表達(dá)下降,vimentin表達(dá)增加。6μ M的Celecoxib刺激MCF-7細(xì)胞24 h即可以出現(xiàn)E-cad下降及vimentin增加,48 h后該效應(yīng)更顯著。
3、TGF-β1導(dǎo)致的A549細(xì)胞E-cad下降及vimentin表達(dá)增加被Etodolac逆轉(zhuǎn)了。Etodol
15、ac單獨(dú)應(yīng)用就可以促進(jìn)A549細(xì)胞表達(dá)E-cad,抑制A549細(xì)胞vimentin的表達(dá)。
結(jié)論
Celecoxib通過Cox-2蛋白非依賴性途徑促進(jìn)EMT。不同的Cox-2抑制劑對(duì)EMT過程的影響不一樣,Celecoxib促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生EMT,但Etodolac抑制A549細(xì)胞的EMT過程。
第三部分:Celecoxib通過激活MEK/ERK通路促進(jìn)EMT。
目的:
探討Cele
16、coxib誘發(fā)A549細(xì)胞發(fā)生EMT的主要機(jī)制。
方法:
1、A549細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞以無血清的DMEM饑餓24 h后,加入不同濃度的Celecoxib(2,4,6μ M)刺激5-180 min,通過western blot的方法檢測(cè)磷酸化MEK、AKT、ERK、Smad2、Smad3(p-AKT、p-ERK、p-Smad2、p-Smad3)及其本底蛋白表達(dá)量。
2、A549細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)條件下,給
17、予6μ MCelecoxib與1μM MEK抑制劑(AZD6244)、PI3K抑制劑(Wortmannin)、AKT抑制劑(MK-2206),通過westernblot的方法檢測(cè)p-MEK、p-AKT、p-ERK、E-cad、vimentin的表達(dá)。
結(jié)果:
1、無論A549還是MCF-7細(xì)胞,Celecoxib均促進(jìn)MEK、AKT、ERK的磷酸化,p-MEK、p-AKT、p-ERK在Celecoxib刺激5-15
18、min左右達(dá)到高峰,可以持續(xù)2-3小時(shí),但Smad2、Smad3蛋白磷酸化不受Celecoxib影響。
2、在A549細(xì)胞,AZD6244抑制了p-ERK的表達(dá),但是p-AKT的表達(dá)增加了,同時(shí)逆轉(zhuǎn)了Celecoxib所致的E-cad下調(diào)。Wortmannin與MK-2206均抑制AKT磷酸化,而ERK的磷酸化卻被增強(qiáng)了;同時(shí),MK-2206加劇了Celecoxib所致的E-cad表達(dá)下降。
3、AZD6244逆轉(zhuǎn)C
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 選擇性COX-2抑制劑抑制傷口瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥作用及機(jī)制研究.pdf
- COX-2與新生鼠腦缺氧缺血的相關(guān)性研究及選擇性COX-2抑制劑的應(yīng)用.pdf
- Celecoxib以非COX-2依賴途徑拮抗順鉑抗胃癌細(xì)胞活性研究.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑與5-Fu合用對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響.pdf
- COX-2抑制劑對(duì)燙傷大鼠COX-2、VEGF表達(dá)的影響.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑治療癌性惡病質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑在骨科圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛的應(yīng)用.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑尼美舒利對(duì)COX-2表達(dá)不同的人卵巢癌細(xì)胞株移植瘤生長(zhǎng)的不同影響.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑在炎癥相關(guān)角膜新生血管中的作用.pdf
- COX-2選擇性抑制劑NJO在SD大鼠體內(nèi)的吸收及排泄.pdf
- COX-2抑制劑celecoxib體外對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2增殖的影響.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍愈合的影響.pdf
- COX-2選擇性抑制劑及黃芪對(duì)急性肺損傷大鼠肺COX表達(dá)影響的研究.pdf
- 二芳基取代雜環(huán)類COX-2選擇性抑制劑的合成.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌新生血管的影響及機(jī)制研究.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑Nimesulide對(duì)肝腫瘤細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響.pdf
- 吡唑類COX-2選擇性抑制劑的設(shè)計(jì)合成及抗炎活性研究.pdf
- 選擇性COX-2抑制劑對(duì)絲裂霉素抗胃癌作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論