Celecoxib以非COX-2依賴途徑拮抗順鉑抗胃癌細(xì)胞活性研究.pdf

1、研究背景:胃癌是世界上最常見的嚴(yán)重危害生命健康的惡性腫瘤之一,在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。臨床上治療胃癌的藥物主要為化療藥物,但現(xiàn)在胃癌的化療面臨低緩解率高毒性的困境。研究開發(fā)新的預(yù)防及治療的途徑,成為克服這個世紀(jì)疾病重要的策略發(fā)展方向。
　　 近30年來的流行病學(xué)及基礎(chǔ)研究表明,炎癥作為一種促癌因素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用,而相關(guān)研究顯示非甾體抗炎藥(NSAIDs)包括低毒副作用的環(huán)氧酶2(cyclooxyge

2、nase2,COX-2)選擇性抑制劑在預(yù)防和治療消化道腫瘤中顯示出了巨大的潛力。COX是花生四烯酸代謝合成前列腺素(prostaglandin)的限速酶。在哺乳動物中至少有兩種同工酶,即COX-1和COX-2。COX-1在大部分正常組織中組成性表達(dá)并維持正常的生理功能,而COX-2在大部分組織中不表達(dá)或低表達(dá),可被炎癥因子、生長因子、腫瘤促進(jìn)因子等誘導(dǎo)表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)多種類型的腫瘤包括胃痛過表達(dá)COX-2。因此,COX-2成為了抗腫瘤研

3、究的一個重要的潛在活性靶點。
　　 目前研究表明:NSAIDs通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤血管的形成等多種機制起到抑制腫瘤生長的作用。除了發(fā)揮直接的抗腫瘤活性外,NSAIDs還具有放療增敏作用。此外,NSAIDs還可以減輕化療藥物引起的靜脈炎,粘膜炎以及腹瀉。然而,NSAIDs與當(dāng)前的一線抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用后,能否增加療效,減少不良反應(yīng)的發(fā)生,目前還不明確。
　　 本研究組已發(fā)現(xiàn)COX-2選擇性抑制劑c

4、elecoxib能夠拮抗順鉑在人食管鱗癌細(xì)胞中的抗腫瘤活性。進(jìn)一步的機理研究顯示celecoxb通過抑制順鉑進(jìn)入細(xì)胞從而減少細(xì)胞內(nèi)順鉑的蓄積以及Pt—DNA加合物的形成,最終拮抗順鉑的抗腫瘤活性。并且,celecoxib的這一作用與它抑制COX-2的活性無關(guān)。體內(nèi)實驗也顯示雖然celecoxib和順鉑單獨用藥都顯示了抗腫瘤活性,但是聯(lián)合用藥后并未增強藥物的抗腫瘤活性。這就提示我們,抑制食管鱗癌細(xì)胞的COX-2活性具有一定的抗腫瘤效果,而

5、COX-2抑制劑和抗腫瘤藥物聯(lián)合使用后則很可能通過非COX-2依賴的途徑對抗腫瘤藥物的活性產(chǎn)生影響。
　　 基于上述研究,本課題在另外一種COX-2高表達(dá)的消化道惡性腫瘤胃癌上研究COX-2抑制劑celecoxib(塞來昔布)、SC-236、nimesulide(尼美舒利)和非選擇性抑制劑indomenthacin(吲哚美辛)與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對人胃癌細(xì)胞的抗腫瘤活性,并進(jìn)一步闡明相關(guān)可能的作用機制。
　　 目的:研究CO

6、X抑制劑(celecoxib、SC-236、nimesulide及indomethacin)與順鉑合用后對人胃癌細(xì)胞的抗腫瘤活性,探討COX抑制劑影響順鉑細(xì)胞毒作用的機制。并且,通過建立裸鼠胃癌移植瘤模型進(jìn)一步研究COX抑制劑對順鉑體內(nèi)抗腫瘤活性的影響。
　　 方法
　　 1.MTT法檢測COX抑制劑對順鉑發(fā)揮細(xì)胞毒作用的影響COX抑制劑(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)

7、聯(lián)合順鉑或順鉑單獨處理胃癌細(xì)胞MKN45、TMK1和AGS,然后MTT法檢測細(xì)胞活力。
　　 2.COX抑制劑對順鉑引起的細(xì)胞凋亡的影響(1)檢測DNA片段化:藥物濃度為20μM的celecoxib和SC-236單獨或與順鉑(0、10、20μM)聯(lián)合處理細(xì)胞,瓊脂糖電泳分析COX-2抑制劑拮抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。
　　 (2)Western blotting檢測PARP的剪切:30μM順鉑單獨或聯(lián)合20μM COX抑

8、制劑(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)處理胃癌細(xì)胞MKN45,作用24 h后提取蛋白,測定蛋白含量,然后取等量蛋白進(jìn)行聚丙酰胺蛋白電泳(SDS-PAGE),檢測PARP剪切。
　　 3.COX抑制劑對細(xì)胞內(nèi)順鉑的蓄積,順鉑與DNA的結(jié)合,細(xì)胞攝入順鉑以及細(xì)胞運出順鉑的影響
　　 (1)COX抑制劑對細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積的影響:30μM順鉑單獨或聯(lián)合20μM的COX抑制劑(cel

9、ecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)處理胃癌細(xì)胞MKN45,作用2 h后收集細(xì)胞,裂解細(xì)胞,電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP—MS)檢測細(xì)胞內(nèi)順鉑含量。
　　 (2)COX抑制劑對Pt-DNA加合物形成的影響:30μM順鉑單獨或聯(lián)合20μM的COX抑制劑(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)處理胃癌細(xì)胞MKN45,作用2 h后收集細(xì)胞,Wizard

10、 SV Genomic DNA Purlfication System試劑盒提取細(xì)胞DNA,ICP-MS檢測Pt—DNA加合物的形成。
　　 (3)COX抑制劑對細(xì)胞攝入順鉑的影響:30μM順鉑單獨或聯(lián)合20μM的COX抑制劑(celecoxib、SC-236、indomethacin和nimesulide)處理胃癌細(xì)胞MKN45,作用5 min后收集細(xì)胞,裂解細(xì)胞,ICP-MS檢測細(xì)胞內(nèi)順鉑含量。
　　 (4)COX抑

11、制劑對細(xì)胞運出順鉑的影響:30μM順鉑處理MKN45細(xì)胞2 h后,PBS充分洗滌細(xì)胞,然后加入不含順鉑的培養(yǎng)基或COX抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h。收集并裂解細(xì)胞,ICP-MS檢測細(xì)胞內(nèi)順鉑含量。
　　 4.裸鼠移植瘤模型研究celecoxib對順鉑體內(nèi)抗腫瘤活性的影響4到6周的雌性隊LB/c nu/nu裸鼠用于實驗研究。將MNK45細(xì)胞懸液接種到裸鼠的右背部皮下,每只裸鼠接種2×106個細(xì)胞。然后每兩天用游標(biāo)卡尺測量一次腫瘤的大小。腫

12、瘤的大小按照以下公式計算:V(體積)=L×W2/2,其中L是腫瘤縱軸的長度,W是腫瘤橫軸的長度。接種后10天,所有老鼠都長出明顯腫瘤。將裸鼠隨機分為4組,按以下方案給藥:(1)對照組；(2)順鉑給藥組,每周給藥一次,每次腹腔注射2 mg/Kg,共4周；(3)celecoxib給藥組,每天給藥一次,灌胃給藥100 mg/Kg,共4周；(4)順鉑和celecoxib聯(lián)合用藥組,兩種藥均按照上兩組給藥方式。給藥結(jié)束后,處死裸鼠并取出腫瘤組織,

13、根據(jù)腫瘤大小,評價celecoxib對順鉑體內(nèi)抗腫瘤活性影響。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)分析和作圖依據(jù)均是由GraphPad Prism4.03(數(shù)據(jù)分析和作圖軟件),所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。
　　 結(jié)果:
　　 1.COX-2選擇性抑制劑celecoxib和SC-236拮抗了順鉑對人胃癌細(xì)胞(MKN45、TMK1和AGS)的細(xì)胞毒作用,而非選擇性COX抑制劑indomethacin和

14、另一個COX-2選擇性抑制劑nimesulide對順鉑的細(xì)胞毒作用沒有影響。
　　 2.瓊脂糖電泳分析顯示:celecoxib和SC-236能夠顯著減弱順鉑引起的DNA片段化；Western blotting結(jié)果顯示:celecoxib與SC-236抑制了順鉑引起的PARP剪切,而nimesulide和indomethacin不影響順鉑引起的PARP剪切。
　　 3.ICP-MS結(jié)果顯示celecoxib和SC-236降

15、低了順鉑在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積蓄,并減少了Pt—DNA加合物的形成。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),celecoxib和SC-236通過減少順鉑的攝入以及增加順鉑的運出來減少順鉑在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。
　　 4.裸鼠移植瘤實驗顯示,順鉑、celecoxib單獨以及兩藥合用均能夠明顯減少腫瘤的大??；然而,聯(lián)合用藥的抗腫瘤活性并不強于單獨用藥。
　　 結(jié)論:COX-2選擇性抑制劑celecoxib以非COX-2依賴途徑拮抗順鉑在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

16、。相關(guān)研究結(jié)果表明:COX-2選擇性抑制劑celecoxib和SC-236拮抗了順鉑的細(xì)胞毒作用,而另一個COX-2選擇性抑制劑nimesulide和非選擇性抑制劑indomethacin并不影響順鉑的細(xì)胞毒作用。這一結(jié)果提示celecoxib通過非COX-2依賴的途徑拮抗順鉑的細(xì)胞毒作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)celecoxib通過減少順鉑的攝入和增加順鉑的運出,引起細(xì)胞內(nèi)順鉑蓄積的減少以及Pt—DNA加合物形成的減少。此外,裸鼠胃癌移植瘤