RNA干擾技術(shù)沉默iNOS基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞增殖活性及COX-2表達(dá)的影響.pdf

1、舌鱗狀細(xì)胞癌(Tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，約占頭頸部腫瘤的40-50﹪，手術(shù)、放療、化療是目前主要的治療手段，但總的治療效果并不理想，5年生存率仍只有60﹪左右，而且患者生存質(zhì)量也不高。 癌的發(fā)生是一個多因素、多階段、復(fù)雜漸進(jìn)的過程，干預(yù)或終止其中某個或多個相關(guān)因素或過程，能夠改變癌發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，達(dá)到化學(xué)預(yù)防和治療的目的。針對腫瘤相關(guān)因子，明確基因功能，

2、選擇靶點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)干預(yù)，是惡性腫瘤的預(yù)防和治療策略。癌化學(xué)預(yù)防(cancer chemoprevention)就是利用天然化學(xué)物質(zhì)和合成化學(xué)物質(zhì)，開展抑制或延遲從正常細(xì)胞發(fā)展到進(jìn)行期癌的癌變過程。實(shí)施癌的化學(xué)預(yù)防首要的是確定和選擇作用靶點(diǎn)，即研究腫瘤相關(guān)基因的功能和表達(dá)。 一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物體內(nèi)一種小分子氣體。它為一種結(jié)構(gòu)簡單的自由基，具有氧化還原性。NO具有十分重要的生理功能，其通過第二信使以及神經(jīng)

3、遞質(zhì)的性能，參與調(diào)節(jié)生物體的循環(huán)、神經(jīng)、免疫等一系列生理過程，同時也參與包括腫瘤在內(nèi)的許多病理過程。NO為一種自由基，通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用；然而近期的大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，NO與一些腫瘤相關(guān)因子相互作用，具有促進(jìn)腫瘤生長、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。NO對腫瘤的“雙刃劍”作用與腫瘤組織局部NO濃度、腫瘤類型、以及腫瘤細(xì)胞對NO的敏感性等多種因素有關(guān)。 內(nèi)源性NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，N

4、OS)以L-精氨酸為底物氧化合成的，NOS的表達(dá)是衡量內(nèi)源性NO的重要指標(biāo)。生物體內(nèi)的NOS至少有三種類型，其中誘導(dǎo)型(iNOS)由活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，作用緩慢而持久，其產(chǎn)生的NO量較多。許多腫瘤細(xì)胞中均可見iNOS表達(dá)，但不同類型的腫瘤組織中iNOS的表達(dá)和NO的釋放有所不同。頭頸部腫瘤中iNOS的表達(dá)比正常粘膜中的表達(dá)要高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的iNOS的活性比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移要高得多。前列腺素E2及其合成酶環(huán)氧合酶-2(COX-2)在腫瘤

5、發(fā)生發(fā)展有很多分子機(jī)制發(fā)揮作用，如如前列腺素的生物合成、促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞調(diào)亡抑制、免疫抑制、異生化合物代謝等。COX-2與iNOS之間存在一種“串話”(cross talk)機(jī)制，COX-2和iNOS在組織分布，表達(dá)調(diào)控等方面表現(xiàn)相似，共同參與一些生理、病理過程、相互作用能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，表現(xiàn)為協(xié)同作用。COX-2和iNOS間的分子相互作用機(jī)制還沒有完全明了，不同的研究甚至出現(xiàn)相反的結(jié)論。這兩種酶在舌鱗癌表達(dá)增高的原因及其在舌

6、鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用具體機(jī)制和兩者抑制劑在舌鱗癌的防治作用是進(jìn)一步研究的目標(biāo)。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。RNAi是真核生物中普遍存在，是生物體在進(jìn)化上的一種保守的基因組水平的免疫監(jiān)控機(jī)制。作為一種新的反向遺傳學(xué)研究基因功能的方法克服了正向遺傳學(xué)中預(yù)測性基因功能分析的存在假陽結(jié)論的缺點(diǎn)，這種高通量的基因沉默技

7、術(shù)能夠抑制生物體基因組內(nèi)每一條基因的表達(dá)，從整體系統(tǒng)地研究基因的功能及不同基因間的關(guān)系。 為了進(jìn)一步探討iNOS和COX-2基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖活性的影響以及兩個因子表達(dá)間的關(guān)系，為后期進(jìn)行體內(nèi)和臨床實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)采用了RNA干擾技術(shù)，通過陽離子脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE 2000介導(dǎo)，將含有針對iNOS的特異性stealth RNA轉(zhuǎn)染入舌鱗癌細(xì)胞Tca113中。流式細(xì)胞儀和MTT法分別檢測Tca8113細(xì)胞

8、的凋亡和增殖活性的變化情況；RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測手段，分別從mRNA水平檢測iNOS和COX-2基因的表達(dá)改變情況。 本研究分兩個部分進(jìn)行： 第一部分：RNA干擾iNOS基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞增殖活性影響的實(shí)驗(yàn)研究為研究NO和iNOS對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)用脂質(zhì)體LIPOFECTAMIN<'TM>2000介導(dǎo)，將invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成的iNOS特異性的Stealth RNA轉(zhuǎn)染入舌鱗癌Tea8113細(xì)胞

9、株，同時設(shè)立陰性對照和空白對照。免疫組化檢測細(xì)胞中iNOS的蛋白表達(dá)改變情況；流式細(xì)胞儀檢測Tca8113細(xì)胞的凋亡率；MTT法繪出各組細(xì)胞的生長曲線，以進(jìn)一步檢測細(xì)胞增殖活性的變化情況。 免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組Tca8113細(xì)胞中iNOS表達(dá)水平低于兩對照組；實(shí)驗(yàn)組(iNOS組)的腫瘤細(xì)胞凋亡率高于兩對照組，而兩對照組之間的凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明RNAi降低iNOS基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞的凋亡有所增加；根據(jù)吸光度OD值繪制

10、出生長曲線(見附圖1-8)。從圖可見實(shí)驗(yàn)組Tca8113細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制。 第二部分：iNOS基因沉默抑制Tca8113細(xì)胞COX-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究前期實(shí)驗(yàn)已證明RNAi能讓iNOS基因表達(dá)下降，為了能進(jìn)一步探討iNOS基因是否存在對腫瘤細(xì)胞COX-2的表達(dá)有調(diào)控作用，為后期進(jìn)行體內(nèi)和臨床實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)采用LIPOFECTAMINE 2000脂質(zhì)體介導(dǎo)，將含有iNOS特異性的Stealth RNA轉(zhuǎn)染入舌

11、鱗癌Tca8113細(xì)胞中，通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測手段，從mRNA水平檢測Tca8113細(xì)胞中iNOS和COX-2表達(dá)的改變情況。 結(jié)果顯示iNOS特異性Stealth RNA轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞后，iNOS基因和COX-12基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均有降低。 結(jié)論 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論： 1．舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中有iNOS和COX-2的高表達(dá)； 2.RNAi可以降低i