COX-2熒光探針的合成及其對肝細(xì)胞肝癌診斷作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌在全世界每年的新發(fā)病例大約為70萬例，目前已經(jīng)成為一種嚴(yán)重影響生命健康的惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌主要包括肝細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤和肝血管肉瘤。其中，肝細(xì)胞肝癌所占的比例最高，占原發(fā)性肝癌的80％以上。在亞洲特別是中國的肝癌發(fā)病率明顯高于世界平均水平，有報(bào)道指出，全世界的肝癌患者50％以上集中在中國。肝細(xì)胞性肝癌發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素有:肝炎病毒感染(在我國主要為乙型肝炎病毒感染)、大量飲酒、長期攝入黃曲霉素污染的食物、肥胖

2、、吸煙、脂肪肝、糖尿病等等。在不同的國家和地區(qū)，肝細(xì)胞肝癌的主要危險(xiǎn)因素往往不盡相同，以上種種均對肝癌的臨床診斷、治療以及患者的預(yù)后造成影響。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前我國肝細(xì)胞肝癌的死亡率已經(jīng)占到我國所有癌癥的18.8％。到目前為止，肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療措施仍然是以手術(shù)為主的綜合治療，且手術(shù)切除被認(rèn)為是早期肝癌患者的首選的且最有效的治療措施，術(shù)后患者的5年生存率可以達(dá)到60％-70％，有些患者甚至可以達(dá)到根治的效果。隨著術(shù)前影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)的進(jìn)

3、步，肝癌患者的術(shù)前評估如child-pugh肝功能評級、吲哚菁綠清除實(shí)驗(yàn)(ICG15)及肝靜脈壓力梯度等檢測更加完善。隨著醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療器械的創(chuàng)新及進(jìn)步，如超聲刀、氬氣刀、區(qū)域肝血流阻斷等技術(shù)的不斷發(fā)展，對肝臟本身解剖結(jié)構(gòu)的重新認(rèn)識和臨床醫(yī)生手術(shù)水平的提高，肝癌患者的圍手術(shù)期死亡率明顯下降，一些大的醫(yī)療中心可以將死亡率控制在1％-5％。然而，肝癌患者的長期預(yù)后仍然達(dá)不到滿意的效果。導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌預(yù)后不良的因素有很多:早期沒有明確的臨床癥

4、狀，發(fā)生臨床癥狀就醫(yī)時(shí)往往已發(fā)展到進(jìn)展期、對放化療等腫瘤治療手段不敏感、腫瘤手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高及往往較早出現(xiàn)的多部位、多器官轉(zhuǎn)移等等。在這些原因當(dāng)中，肝癌手術(shù)過程中原發(fā)灶的殘留及轉(zhuǎn)移灶未得到足夠的清除是肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)的最常見原因。肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)已經(jīng)嚴(yán)重影響到肝癌患者的治療效果及預(yù)后。然而，目前對這兩方面的判斷往往需要腫瘤達(dá)到一定體積且周邊組織出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶后才能得到明確的判斷，且這種判斷往往需要根據(jù)臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)來完成。怎樣找到一種

5、能夠讓臨床醫(yī)生更直觀、準(zhǔn)確的判定腫瘤存在及手術(shù)切除范圍的方法，是廣大科研人員及臨床工作者的迫切需求，也是本實(shí)驗(yàn)想解決的問題。
　　隨著人們對熒光現(xiàn)象的不斷認(rèn)識及各種特異性熒光染料的不斷發(fā)展，熒光識別檢測技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛。對生物體內(nèi)某些細(xì)胞或是細(xì)胞器所存在或表達(dá)的某些特異性指標(biāo)進(jìn)行識別，并將這些生物體內(nèi)的微觀信號通過某種手段轉(zhuǎn)化成可被儀器或人所直接識別的宏觀信號的方法及過程稱為生物識別。可以用于生物識別的一類與

6、細(xì)胞生長、分化、增值、變性、凋亡的一類特征性生物產(chǎn)物被稱為生物標(biāo)志物。在生物學(xué)的研究領(lǐng)域上，生物標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)、生物代謝等相關(guān)領(lǐng)域。因其生理特性和其微觀性的表現(xiàn)方式，生物標(biāo)志物具有高準(zhǔn)確性及高敏感性的特點(diǎn)，可以在生物學(xué)行為改變的早期，未表現(xiàn)出明顯宏觀變化時(shí)對這種改變做出反應(yīng)。通過某些特殊的設(shè)備和技術(shù)，可以將生物標(biāo)志物發(fā)生的微觀變化形成可被觀測到的現(xiàn)象，從而達(dá)到對生物分子的識別，特異性疾病的診斷以及針對某些靶相位點(diǎn)進(jìn)行生

7、物學(xué)治療的目的。其中，生物識別技術(shù)與熒光顯色技術(shù)相結(jié)合既構(gòu)成熒光探針技術(shù)。
　　熒光探針(fluorescence probe)指在紫外-可見-近紅外區(qū)有特征熒光，并且其熒光性質(zhì)(激發(fā)和發(fā)射波長、強(qiáng)度、壽命、偏振等)可隨所處環(huán)境的性質(zhì)，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。目前，在生物研究中，常利用熒光探針與核酸(DNA/RNA)、蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)構(gòu)發(fā)生非共價(jià)相互作用，使其熒光性質(zhì)發(fā)生改變，發(fā)出特異性熒光，通

8、過檢測這些熒光信號，達(dá)到檢測生物體中某種物質(zhì)變化的目的。
　　COX-2是環(huán)氧合酶的誘發(fā)性亞形，在正常組織中很少表達(dá)或不表達(dá)，在受到炎癥、腫瘤等外界刺激時(shí)發(fā)生高表達(dá)。目前，已發(fā)現(xiàn)COX-2在胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中表達(dá)升高，并有多項(xiàng)研究證明COX-2與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為均具有密切的關(guān)系。因?yàn)镃OX-2的這一特點(diǎn)，我們考慮將其作為腫瘤的生物標(biāo)志物用于腫瘤的檢測與識別。
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光探針標(biāo)

9、記肝臟腫瘤組織中高表達(dá)而在正常肝組織中不表達(dá)的生物標(biāo)記物COX-2，使其發(fā)出可見光波長范圍內(nèi)并可被儀器及肉眼識別的熒光，達(dá)到鑒別腫瘤的目的。從而為肝細(xì)胞肝癌的生物學(xué)研究、實(shí)驗(yàn)診斷、術(shù)中肝癌原發(fā)灶的判定及轉(zhuǎn)移灶的鑒別提供一種新的思路與方法。
　　目的:
　　合成可以靶向到COX-2的熒光探針并應(yīng)用其對肝癌細(xì)胞、組織和動物模型進(jìn)行熒光染色，探討其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.應(yīng)用熒光基團(tuán)和COX-2識別基

10、團(tuán)合成熒光探針。
　　2.對熒光探針X進(jìn)行了光穩(wěn)定性、COX-2識別特異性等性質(zhì)的測定。
　　3.應(yīng)用western blot技術(shù)驗(yàn)證人肝癌細(xì)胞SMMC7721、BEL7402及正常肝細(xì)胞LO2中的COX-2蛋白表達(dá)情況。
　　4.應(yīng)用熒光探針X對上述細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。
　　5.驗(yàn)證了熒光探針是通過靶向到COX-2蛋白后形成的腫瘤細(xì)胞熒光顯色。
　　6.驗(yàn)證了熒光探針的細(xì)胞毒性。
　　7.制作了裸鼠人

11、肝癌細(xì)胞皮下轉(zhuǎn)移瘤模型并對其進(jìn)行了活體熒光染色。
　　8.對手術(shù)切除的人肝癌組織和正常肝組織進(jìn)行了對比熒光染色。
　　結(jié)果:
　　1.合成的熒光探針X能通過結(jié)合COX-2蛋白產(chǎn)生熒光，光學(xué)穩(wěn)定性良好。
　　2.人肝癌細(xì)胞SMMC7721、BEL7402可被熒光探針X進(jìn)行熒光顯色，且western blot技術(shù)證實(shí)其高表達(dá)COX-2。
　　3.熒光探針可以實(shí)現(xiàn)對肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的熒光區(qū)分。
　　4.

12、熒光探針對肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的熒光區(qū)分是通過特異性結(jié)合COX-2實(shí)現(xiàn)的。
　　5.熒光探針在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中未見明顯細(xì)胞毒性。
　　6.熒光探針可對裸鼠的人肝癌皮下轉(zhuǎn)移瘤形成熒光染色。
　　7.熒光探針能夠?qū)κ中g(shù)切除的肝癌組織和正常肝組織進(jìn)行熒光區(qū)分。
　　結(jié)論:
　　合成的熒光探針X可以通過靶向到COX-2蛋白從而對肝癌細(xì)胞、肝癌組織及裸鼠人肝癌細(xì)胞皮下轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生熒光現(xiàn)象并能與正常肝細(xì)胞和組織區(qū)分，有進(jìn)一步