K141N突變型HSP22蛋白對(duì)線粒體的影響及其在腓骨肌萎縮癥2L發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景:
　　腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-ToothDisease，CMT)于1886年由Charcot、Marie和Tooth首次報(bào)道，是一類最常見的遺傳性周圍神經(jīng)病，發(fā)病率約為1/2500。根據(jù)其病理和臨床電生理特點(diǎn)，CMT可分為3型:脫髓鞘型(CMT1型)，軸索型(CMT2型)以及中間型(IntermediateCMT，ICMT)。常染色體顯性遺傳是最常見的遺傳方式，常染色體隱性遺傳、X連鎖顯性或隱性遺傳一般

2、少見。到目前為止已有40多個(gè)不同的CMT致病基因被定位，其中至少30個(gè)基因已被克隆。小分子熱休克蛋白22(HeatShockProtein22，HSP22)基因的點(diǎn)突變(423G→T)導(dǎo)致氨基酸K141N替換，通過共分離分析等研究表明其為CMT2L型致病突變。在已發(fā)現(xiàn)的CMT2型致病基因中，HSP27、NEFL、GDAP1、MFN2、KIF1B、DHTKD1突變后通過改變線粒體分裂融合、線粒體的能量代謝或線粒體的軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致軸索型CM

3、T，因此軸索型CMT可以看作與線粒體密切相關(guān)的疾病。另外Irobi等分離HSP22突變致dHMN(II)患者的皮膚成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位異常，提示CMT2L很可能也存在線粒體異常。
　　研究目的:
　　本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)觀察細(xì)胞線粒體的形態(tài)功能改變，研究HSP22蛋白變異所致CMT2L是否存在線粒體的形態(tài)功能異常，為揭示CMT2L的發(fā)病機(jī)制和探索其治療方法提供新的線索。
　　研究方法:
　

4、　(1)采用免疫熒光技術(shù)觀察HSP22蛋白變異對(duì)細(xì)胞線粒體的影響
　　(2)通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HSP22蛋白變異對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響
　　(3)利用慢病毒感染脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，通過免疫熒光技術(shù)觀察HSP22蛋白變異對(duì)線粒體軸漿運(yùn)輸?shù)挠绊?br>　　結(jié)果:
　　(1)pLVX-Puro-EGFP-HSP22WT、pLVX-Puro-EGFP-HSP22MT轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)野生型組細(xì)胞內(nèi)線

5、粒體無異常改變，突變型組細(xì)胞內(nèi)線粒體呈異常斑塊狀聚集，并且與異常聚集的HSP22共定位。
　　(2)pLVX-Puro-EGFP-HSP22WT、pLVX-Puro-EGFP-HSP22MT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)野生型線粒體無異常改變，K141N突變型HSP22蛋白在胞內(nèi)形成聚集物，線粒體無異常聚集，HSP22與線粒體不存在共定位關(guān)系。
　　(3)pCDNA3.1(+)-HSP22WT、pCDNA

6、3.1(+)-HSP22MT轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位改變。對(duì)照組、突變型組膜電位無明顯差別。野生型和突變型組細(xì)胞分別用CCCP處理后，兩組細(xì)胞線粒體膜電位均降低，野生型組線粒體膜電位高于突變型線粒體膜電位。
　　(4)采用慢病毒技術(shù)建立脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CMT2L模型。野生型組線粒體均勻分布于神經(jīng)元胞體和軸突，HSP22蛋白無異常聚集，突變型組軸突可見線粒體聚集呈異常團(tuán)塊，在聚集遠(yuǎn)端出現(xiàn)線粒體缺失，并與K1

7、41N突變型HSP22蛋白共定位。
　　結(jié)論:
　　(1)HSP22突變后神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞內(nèi)線粒體呈異常斑塊狀聚集，并且與異常聚集的HSP22共定位。
　　(2)K141N突變型HSP22對(duì)線粒體無損傷性作用，應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)作用下降或丟失。
　　(3)HSP22突變后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突內(nèi)線粒體呈異常團(tuán)塊聚集，在聚集遠(yuǎn)端出現(xiàn)線粒體缺失，與K141N突變型HSP22蛋白共定位，提示HSP22蛋白可能影響線粒體的軸漿