鋅α2糖蛋白對線粒體生物合成相關(guān)因子的影響及其信號通路機(jī)制.pdf

1、目的:構(gòu)建重組小鼠鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein)真核表達(dá)載體,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞,觀察3T3-L1細(xì)胞過表達(dá)ZAG后對線粒體生物合成相關(guān)因子的影響。
　　方法:提取正常小鼠肝臟組織總RNA,通過RT-RCR方法擴(kuò)增出ZAG序列,克隆入經(jīng)Xba?和HindШ雙酶切后的pcDNA3.1(-),重組小鼠ZAG真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1(-)-mZAG)經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,篩選陽性克隆,酶切和核

2、苷酸測序鑒定后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞,G418篩選陽性克隆擴(kuò)增,RT-PCR法鑒定 ZAG陽性細(xì)胞株并檢測過氧化物酶增殖型受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1/2(NRF-1/2)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mtTFA)mRNA表達(dá), Western Blot檢測PGC-1α、NRF1/2、mtTFA蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功克隆小鼠ZAG cDNA全序列,并將其與pcDNA3.1(-)載體片段連接,構(gòu)建成 pcD

3、NA3.1(-)-mZAG表達(dá)質(zhì)粒。重組真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Xba?和HindШ酶切后獲得5.4kb和924bp兩個片段,大小與理論值一致,并由核苷酸序列測定證實。pcDNA3.1(-)-mZAG成功轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染的3T3-L1細(xì)胞中ZAG基因的轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào),過表達(dá)ZAG后,PGC-1α、NRF-1/2、mtTFA表達(dá)均上調(diào)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建ZAG基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-mZAG,構(gòu)建