PDTC抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)肺癌端粒酶的影響及其在hTERT-siRNA干擾早期對(duì)線粒體損傷的作用研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　在我國(guó),肺癌居于所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率的首位。目前對(duì)于肺癌的治療方法包括手術(shù)治療,放療,化療,靶向治療等,形成了多種學(xué)科的綜合治療方案。但肺癌總的五年生存率仍為10％以下,因此學(xué)者們?cè)趯ふ覍?duì)肺癌新的療法的同時(shí),努力探索肺癌在發(fā)生,發(fā)展,治療過程中的具體機(jī)制,從而改善這一現(xiàn)狀。
　　研究發(fā)現(xiàn)：端粒酶(telomerase)與肺癌的發(fā)生,發(fā)展,轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系,其可以通過自身的模板和逆轉(zhuǎn)錄活性促使細(xì)胞縮

2、短的端粒(telomere)延長(zhǎng),從而導(dǎo)致細(xì)胞的無限分裂增殖能力。端粒酶是由RNA組分和蛋白組分組成的核糖核蛋白復(fù)合體,端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)是端粒酶的主要成分,是端粒酶發(fā)揮活性和細(xì)胞癌變的限速因素。hTERT在細(xì)胞內(nèi)可以定位于細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中,在不同細(xì)胞器中發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用。而且隨著體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變,藥物的作用,hTERT在不同細(xì)胞器之間

3、的含量會(huì)改變。利用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù),合成特異性抑制hTERT的小干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)降解hTERTmRNA,進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá),最終可達(dá)到調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。在RNAi導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的過程中,必然會(huì)引起細(xì)胞活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)的改變從而引起hTERT在不同細(xì)胞器之間的轉(zhuǎn)位。那么在hTERT轉(zhuǎn)位過程中是由

4、哪種信號(hào)通路來介導(dǎo)?
　　核因子kB(NuclearfactorkBNF-κB)體系主要涉及機(jī)體防御反應(yīng),應(yīng)激,細(xì)胞分化和凋亡等過程的信息傳遞。在病毒,活性氧中間體,脂多糖的刺激下可激活NF-κB?；罨腘F-κB進(jìn)入細(xì)胞核,可調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明:NF-κB信號(hào)通路與hTERT密切相關(guān)。同時(shí)NF-κB可以結(jié)合hTERT啟動(dòng)子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平hTERT含量。進(jìn)一步表明通過LPS或者M(jìn)G-132改變NF-κB的活性可以同步調(diào)節(jié)

5、hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)。然而上述的研究并沒有考慮到ROS作為NF-κB的激活信號(hào)在NF-κB引起的hTERT改變中的作用。
　　本研究以抗氧化劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(AmmoniumpyrrolidinedithiocarbamatePDTC)來抑制NF-κB信號(hào)通路。研究其對(duì)肺癌細(xì)胞株H1299中hTERT表達(dá)量的影響并進(jìn)一步觀察PDTC抑制NF-κB信號(hào)通路后對(duì)hTERT-siRNA干擾細(xì)胞早期線粒體損傷的影響。從而完

6、善以hTERT為靶點(diǎn)抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制研究。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1.用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度PDTC作用不同時(shí)間下對(duì)肺腺癌細(xì)胞株H1299的存活、凋亡影響。
　　2.用RealTimeRT-PCR技術(shù)、westernblot技術(shù)檢測(cè)PDTC不同濃度,不同時(shí)間下對(duì)H1299中hTERTmRNA和蛋白含量的影響并結(jié)合CC-8實(shí)驗(yàn)確立下一步實(shí)驗(yàn)所需要的PDTC濃度和作用時(shí)間。
　　3.用RFQ-PCR技術(shù)檢

7、測(cè)hTERT-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299后不同時(shí)間點(diǎn)的線粒體損傷和PDTC作用后hTERT-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299的線粒體損傷。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8結(jié)果顯示:不同濃度的PDTC分別作用于H1299細(xì)胞后細(xì)胞的生長(zhǎng)受明顯抑制,且抑制作用隨著濃度和時(shí)間的增加而增加,呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的依賴性。
　　2.RealTimeRT-PCR結(jié)果表明:PDTC作用濃度的提高,作用時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)hTERT-mRNA的抑制

8、效率逐步增加。各時(shí)間段之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P<0.05)其中PDTC濃度為100μmol/L,200μmol/L時(shí)hTERT-mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較12小時(shí)為(79.78±1.29)%,(69.42±1.42)%;24小時(shí)為(53.45±2.52)%,(37.02±1.16)%;48小時(shí)的細(xì)胞存活率分別為(36.80±2.34)%,(28.37±1.74)%。
　　3.Westernblot結(jié)果表明:低濃度的PDTC對(duì)hT

9、ERT蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無明顯差異(P>0.05),而且各時(shí)間組之間無明顯差異(P>0.05)。而高濃度的PDTC(100,200μmol/L)在24h,48h表現(xiàn)出與對(duì)照組hTERT蛋白表達(dá)明顯的差異,表明在高濃度的PDTC可以抑制hTERT的蛋白量,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用會(huì)增強(qiáng)(P<0.05)。
　　4.對(duì)于正常H1299細(xì)胞,無論是用hTERT-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染還是空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,在早期轉(zhuǎn)染48小時(shí)內(nèi),其線粒體損傷之

10、間并沒有顯著差異(P>0.05)。當(dāng)H1299細(xì)胞在濃度為100μM的PDTC培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后,再轉(zhuǎn)染hTERT-siRNA質(zhì)粒質(zhì)粒表明:可于轉(zhuǎn)染后6h檢測(cè)到相對(duì)正常細(xì)胞組明顯的線粒體損傷(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.PDTC抑制NF-κB信號(hào)通路后可通過進(jìn)一步抑制hTERTmRNA和蛋白的含量促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞株H1299進(jìn)行凋亡。
　　2.PDTC抑制NF-κB信號(hào)通路后可促進(jìn)hTERT-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)