亞洲帶絳蟲(chóng)和鏈狀帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)入侵中間宿主及其致局灶性肝纖維化的研究.pdf

1、目的:
　　亞洲帶絳蟲(chóng)（Taenia asiatica）和鏈狀帶絳蟲(chóng)（Taenia solium）都以家豬為適宜中間宿主并可在豬的肝臟寄生，為何前者僅局限于肝臟，而后者還更廣泛地寄生于豬全身肌肉及腦等組織器官并可導(dǎo)致人囊尾蚴?。繛樘接戇@個(gè)問(wèn)題，本文擬從以下4個(gè)方面進(jìn)行研究:①了解云南大理地區(qū)兩種絳蟲(chóng)流行情況并進(jìn)行蟲(chóng)種分子鑒定和幼蟲(chóng)形態(tài)學(xué)研究;②研究?jī)煞N帶絳蟲(chóng)六鉤蚴和囊尾蚴在豬體的入侵、移行路徑、分布和定植的異同;③研究?jī)烧咧轮虚g宿

2、主肝損傷及局灶性肝纖維化的分子病理機(jī)制;④觀察兩者致靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物囊蟲(chóng)病及肝損害的可能性。
　　方法:
　　1、蟲(chóng)體采集及鑒別
　　在云南大理對(duì)帶絳蟲(chóng)癥患者以口服生南瓜籽、檳榔煎劑驅(qū)蟲(chóng)，生理鹽水反復(fù)清洗，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。
　?、傩螒B(tài)學(xué)鑒別
　　觀察成蟲(chóng)頭節(jié)、孕節(jié)形態(tài)特征，收集蟲(chóng)卵，經(jīng)酶法孵育后，取純化的六鉤蚴接種至免疫抑制的小鼠皮下，55～60天后檢獲囊尾蚴;以形態(tài)特征不典型的疑似鏈狀帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵感染獼猴，觀察囊尾

3、蚴在獼猴體內(nèi)的分布;以普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡分別觀察囊尾蚴的形態(tài)。
　?、诜肿由飳W(xué)鑒別
　　提取蟲(chóng)體DNA，并取已知亞洲帶絳蟲(chóng)和牛帶絳蟲(chóng)作對(duì)照，分別以亞洲帶絳蟲(chóng)、鏈狀帶絳蟲(chóng)和牛帶絳蟲(chóng)特異性引物和通用引物進(jìn)行cox1片段或全基因的PCR擴(kuò)增，從3種帶絳蟲(chóng)PCR陽(yáng)性的擴(kuò)增產(chǎn)物中各選擇1份進(jìn)行核酸序列測(cè)定，序列登錄至GenBank，并用NCBI Blast將各核酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中帶絳蟲(chóng)的cox1進(jìn)行比對(duì)分析。

4、>　　2、兩種帶絳蟲(chóng)六鉤蚴對(duì)感染初期實(shí)驗(yàn)家豬腸黏膜屏障的破壞及其在宿主體內(nèi)移行和分布的觀察
　　①觀察兩種六鉤蚴對(duì)豬腸黏膜屏障功能的影響
　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳豬于感染前抽血進(jìn)行外周血細(xì)菌培養(yǎng)和分離血清備用。分別以鏈狀帶絳蟲(chóng)和亞洲帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵經(jīng)消化道感染實(shí)驗(yàn)組乳豬，感染第4天，無(wú)菌操作抽血分別進(jìn)行外周血細(xì)菌培養(yǎng)和分離血清備用;采用比色法定量檢測(cè)血清D-乳酸，顯色基質(zhì)鱟試劑法定量檢測(cè)血清內(nèi)毒素;取部分小腸組織經(jīng)固定后分別進(jìn)行常規(guī)石

5、蠟包埋切片HE染色和超薄切片制備，分別以光鏡和透射電鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　②觀察兩種六鉤蚴經(jīng)消化道感染家豬后在小腸及相鄰組織器官的分布，探討其移行路徑
　　于感染第4天取家豬小腸、腸系膜、腸系膜上淋巴結(jié)和肝臟進(jìn)行消化、過(guò)濾、離心和分離，分別通過(guò)顯微鏡下仔細(xì)尋找和觀察六鉤蚴的存在，并且采用PCR技術(shù)檢查兩種絳蟲(chóng)DNA的cox1片段在各組織的存在。
　?、鄱o脈注射感染亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴后蟲(chóng)體在幼豬體內(nèi)分布和致病的觀察

6、r>　　以耳靜脈注射的方式使幼豬感染亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴，第35天剖檢，取病變組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，觀察六鉤蚴在幼豬體內(nèi)各組織器官定植、發(fā)育和引起病變的情況，并采用PCR擴(kuò)增組織中亞洲帶絳蟲(chóng)cox1片段。
　　3、帶絳蟲(chóng)囊尾蚴致家豬局灶性肝纖維化的病理和分子病理觀察
　　分別以亞洲帶絳蟲(chóng)和鏈狀帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵經(jīng)消化道感染家豬，于感染第70天剖檢，以放射免疫法進(jìn)行血清透明質(zhì)酸的檢測(cè)、ELISA法進(jìn)行肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的檢測(cè);取肝組織固定后

7、分別經(jīng)HE染色和改良Masson染色觀察病理特征，以免疫組化法檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)。
　　4、囊尾蚴致局灶性肝纖維化小動(dòng)物模型的建立
　　以兩種帶絳蟲(chóng)的六鉤蚴經(jīng)尾靜脈注射感染小鼠構(gòu)建囊尾蚴致肝纖維化小動(dòng)物模型，感染第55～60天取肝組織以10％中性甲醛固定后分別經(jīng)HE染色和改良Masson染色觀察病理特征，以免疫組化法檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)。
　　5、兩

8、種帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵感染獼猴的實(shí)驗(yàn)研究
　　以兩種帶絳蟲(chóng)的蟲(chóng)卵分別經(jīng)消化道感染獼猴。鏈狀帶絳蟲(chóng)感染的獼猴于感染第84天，亞洲帶絳蟲(chóng)感染的獼猴于感染第44天抽血分離血清，以全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行肝功能檢測(cè)、固相放射免疫法進(jìn)行血清透明質(zhì)酸檢測(cè)，ELISA法檢測(cè)囊尾蚴IgG，并對(duì)獼猴進(jìn)行肝臟彩超檢查;鏈狀帶絳蟲(chóng)感染的獼猴于感染第90天，亞洲帶絳蟲(chóng)感染的獼猴于感染第50天剖檢，仔細(xì)檢查肝臟病變，取肝組織以10％中性甲醛固定后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察病

9、變特征。
　　結(jié)果:
　　1、蟲(chóng)種的鑒別
　?、傩螒B(tài)學(xué)鑒別
　　在云南大理共采集到29條帶絳蟲(chóng)，其中25條孕節(jié)子宮分支數(shù)大于15，初步鑒別為亞洲帶絳蟲(chóng);4條孕節(jié)子宮分支數(shù)為7～12，其中一條頭節(jié)受損，形態(tài)特征不清楚，另三條有頂突但小鉤數(shù)目異常，分別為0、4和10，初步鑒定為鏈狀帶絳蟲(chóng)。亞洲帶絳蟲(chóng)的囊尾蚴有頂突但無(wú)小鉤，掃描電鏡下見(jiàn)囊壁表面有疣狀突起，頭節(jié)頂部有吻狀頂突，頂突處無(wú)小鉤，但卻分布大量的菜花樣突起，吸盤(pán)

10、成發(fā)髻樣。小鉤數(shù)目異常的鏈狀帶絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)感染獼猴后，幼蟲(chóng)可寄生于獼猴的肌肉和肝臟，肌肉中的囊尾蚴呈現(xiàn)典型的豬囊尾蚴特征，有頂突及內(nèi)外兩圈共28個(gè)小鉤，電鏡下見(jiàn)吸盤(pán)呈火山口狀，囊壁表面雖無(wú)疣狀突起，但卻有許多溝回和皺折。
　?、诜肿由飳W(xué)鑒別:從25條無(wú)頂突的帶絳蟲(chóng)經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增得到亞洲帶絳蟲(chóng)cox1片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與GenBank中多株亞洲帶絳蟲(chóng)cox1的同源性為100％，因此鑒定為亞洲帶絳蟲(chóng);頭節(jié)受損形態(tài)不清和3條頭

11、節(jié)小鉤數(shù)目異常的帶絳蟲(chóng)經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增得到鏈狀帶絳蟲(chóng)cox1片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與GenBank中多株鏈狀帶絳蟲(chóng)cox1的同源性為99.8％，鑒定為鏈狀帶絳蟲(chóng)。
　　2、兩種帶絳蟲(chóng)六鉤蚴對(duì)感染初期實(shí)驗(yàn)家豬腸黏膜屏障的破壞及其在宿主體內(nèi)的移行和分布
　　兩種帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵經(jīng)消化道感染第4天的乳豬中分別有一頭的外周血細(xì)菌培養(yǎng)由感染前的陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，檢出大腸埃希菌和變形桿菌;各感染乳豬血清D-乳酸和內(nèi)毒素含量均較感染前增高（t檢

12、驗(yàn)，P小于0.05）;光鏡下見(jiàn)腸黏膜明顯損傷，損傷級(jí)別為Ⅲ～Ⅳ級(jí);電鏡觀察顯示小腸上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，線粒體腫脹甚至破裂，小腸微絨毛排列紊亂或脫落。兩種帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵感染的乳豬小腸、腸系膜和腸系膜上淋巴結(jié)可檢出六鉤蚴或/和其DNA。
　　經(jīng)耳靜脈感染家豬的亞洲帶絳蟲(chóng)六鉤蚴可在肝臟發(fā)育成囊尾蚴，在肺、腎、肌肉、皮下和腦組織均未見(jiàn)囊尾蚴，但肝、肺、腎、肌肉和皮下組織均發(fā)現(xiàn)以嗜酸性肉芽腫為主要特征的病變，并且病變組織可擴(kuò)增出亞洲帶絳蟲(chóng)c

13、ox1片段。
　　3、帶絳蟲(chóng)囊尾蚴致家豬局灶性肝纖維化的病理和分子病理改變
　　感染70天后，兩種帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的家豬血清透明質(zhì)酸和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量均較感染前增高，差異有顯著性（P小于0.05）。蟲(chóng)體在宿主肝臟寄生的局部均發(fā)生相似的組織病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為肉芽腫和局灶性肝纖維化，可見(jiàn)肝細(xì)胞水腫和脂肪變性;部分肝細(xì)胞呈小灶性壞死;肝血竇擴(kuò)張、淤血。兩種帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的家豬肝組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，

14、但兩組之間無(wú)明顯差異:TGF-β1在肝竇壁及竇周細(xì)胞、壞死灶及匯管區(qū)，以及纖維間隔和肝細(xì)胞中均有分布;α-SMA廣泛表達(dá)在纖維間隔、肝竇、纖維間隔周?chē)母渭?xì)胞、匯管區(qū)和中央靜脈，而正常對(duì)照組僅在匯管區(qū)血管壁和中央靜脈血管壁有表達(dá)。
　　4、小鼠肝臟組織病理學(xué)改變
　　兩種帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染在小鼠肝臟引起的組織病理學(xué)改變也相似，主要表現(xiàn)為多個(gè)肉芽腫，廣泛的肝纖維化以及大片的肝細(xì)胞壞死，鏈狀帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的小鼠肝臟還可見(jiàn)小膽管增生。

15、感染組小鼠的肝組織TGF-β1和α-SMA的表達(dá)和分布情況與感染組家豬相似，表達(dá)均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。
　　5、兩種帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染獼猴的實(shí)驗(yàn)研究
　　鏈狀帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的獼猴體重較感染前減輕2.4kg;肝臟彩超檢查顯示肝臟內(nèi)多個(gè)結(jié)節(jié)樣回聲;血清總膽汁酸鹽為感染前的4.5倍，透明質(zhì)酸為感染前的1.9倍，膽堿酯酶較感染前降低25％;肝組織內(nèi)見(jiàn)11個(gè)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)可見(jiàn)壞死的蟲(chóng)體和以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，周?chē)w維結(jié)締組織增生，

16、可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性和壞死;血清豬囊尾蚴IgG陽(yáng)性。亞洲帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的獼猴體重較感染前減輕0.7kg，肝臟彩超檢查未見(jiàn)明顯異常;血清亞洲帶絳蟲(chóng)囊尾蚴IgG陰性;肝組織內(nèi)未見(jiàn)蟲(chóng)體和病灶。
　　結(jié)論:
　　云南大理同時(shí)存在亞洲帶絳蟲(chóng)和鏈狀帶絳蟲(chóng)流行;鏈狀帶絳蟲(chóng)頭節(jié)存在頂突小鉤缺失的異常形態(tài)表現(xiàn)，可能是當(dāng)?shù)嘏R床和流行病學(xué)調(diào)查中鏈狀帶絳蟲(chóng)少見(jiàn)的原因之一;利用帶絳蟲(chóng)種特異性引物進(jìn)行cox1片段的PCR擴(kuò)增或通用引物進(jìn)行cox1基因的P

17、CR擴(kuò)增和核酸序列測(cè)定可進(jìn)行人體帶絳蟲(chóng)的分子鑒別。兩種帶絳蟲(chóng)六鉤蚴入侵和突破豬腸黏膜屏障的表現(xiàn)相似，并均可經(jīng)小腸進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)，但亞洲帶絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)僅能適應(yīng)肝臟的內(nèi)環(huán)境并在肝組織生長(zhǎng)和發(fā)育，而與其他組織器官不相容。兩種帶絳蟲(chóng)囊尾蚴在豬肝臟引起相似的病理變化，肝臟的慢性損害刺激TGF-β1的大量表達(dá)，激活HSC，活化的HSC又分泌TGF-β1，促進(jìn)HSC合成細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致局灶性肝纖維化。鏈狀帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵能夠?qū)嶒?yàn)感染靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物獼猴，在肌