亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18芽孢型益生菌口服疫苗的構(gòu)建與生物學(xué)特性研究.pdf

1、1、背景：
　　傳統(tǒng)的分類學(xué)把人體帶絳蟲分為豬帶絳蟲（Taenia solium）和牛帶絳蟲（Taenia saginaia）兩種。近三十年來(lái)，在東南亞和西太平洋的許多國(guó)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)了另一種新的帶絳蟲，其成蟲特征幾乎和牛帶絳蟲一致，而囊尾蚴又與豬帶絳蟲幼蟲相似，寄生在中間宿主豬的體內(nèi)，人因生食豬肝等內(nèi)臟而感染，這種帶絳蟲被命名為亞洲帶絳蟲（Taenia asiatica）。人是以上三種帶絳蟲唯一的終宿主，豬和牛是其主要的中間宿主，

2、豬帶絳蟲蟲卵感染還可引起嚴(yán)重的囊尾蚴?。蚁x?。?。我國(guó)北部和西部地區(qū)是帶絳蟲病和囊蟲病較嚴(yán)重的流行區(qū)。研究證實(shí)在貴州的都勻地區(qū)存在亞洲帶絳蟲的流行，從江地區(qū)存在牛帶絳蟲的流行，患者主要是青壯年，對(duì)當(dāng)?shù)氐膭趧?dòng)生產(chǎn)力影響很大，是危害西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　近幾年來(lái)我們?cè)趤喼迬Ы{蟲的分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、組織病理學(xué)和免疫學(xué)、基因組學(xué)等研究領(lǐng)域做了大量的研究，研究證實(shí)亞洲帶絳蟲的分類學(xué)地位是介于豬帶絳蟲和

3、牛帶絳蟲之間的一個(gè)獨(dú)立種，從分子進(jìn)化的角度分析，其基因序列和蛋白質(zhì)序列與豬帶和牛帶都有很高的同源性。因此可以推斷，亞洲帶絳蟲的某些抗原，可作為豬帶絳蟲和牛帶絳蟲的通用抗原，可作為豬帶絳蟲和牛帶絳蟲免疫診斷和疫苗的候選抗原，利用課題組在亞洲帶絳蟲的地域優(yōu)勢(shì)和基因資源優(yōu)勢(shì)，發(fā)展我國(guó)的帶絳蟲診斷試劑盒和疫苗開(kāi)發(fā)是本研究的主要目標(biāo)，針對(duì)中間宿主（豬、牛）和終宿主（人）的抗感染疫苗是預(yù)防這些寄生蟲病的重要策略?？莶菅挎邨U菌(Bacillus su

4、btilis)作為一種新型口服疫苗載體系統(tǒng)，具有傳統(tǒng)口服疫苗載體不可比擬的優(yōu)勢(shì)：①枯草芽孢桿菌具有良好的安全性，已作為益生菌廣泛應(yīng)用于人及動(dòng)物；②枯草芽孢桿菌耐性強(qiáng)，對(duì)干燥、高溫、高壓、氧化、及酸、堿毒物等等不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，可在室溫條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)存；③枯草桿菌基因組的研究已較完善，枯草桿菌克隆技術(shù)也比較成熟；④以芽孢狀態(tài)口服，枯草芽孢桿菌在排出體外之前，其在小腸有可能經(jīng)過(guò)發(fā)芽、復(fù)制過(guò)程。研究表明，大部分枯草芽孢通過(guò)胃腸道后仍能存活。枯

5、草芽孢衣殼蛋白融合表達(dá)的抗原具有很高的穩(wěn)定性，能抵抗胃酸和腸道消化酶的破壞，維持蛋白穩(wěn)定的構(gòu)象，腸道益生菌枯草芽孢能很好保護(hù)表達(dá)在其表面的抗原，并具有強(qiáng)大的佐劑功能。
　　根據(jù)已知的豬、牛帶絳蟲六鉤蚴18kD基因的序列，我們從亞洲帶絳蟲六鉤蚴中克隆并鑒定了Ta18基因。生物信息學(xué)分析表明，該基因與牛帶絳蟲18kDa蛋白一致性達(dá)99％，與豬帶絳蟲一致性達(dá)97%，所以推斷該基因?yàn)閬喼迬Ы{蟲18kDa基因，命名為Ta18基因。18kD基

6、因被公認(rèn)為是帶絳蟲科最具有前途的疫苗候選基因，同時(shí)，豬帶絳蟲TsOL18和TSOL-45及細(xì)粒棘球絳蟲Eg95的重組抗原免疫保護(hù)性效果已被充分證實(shí)，這類蛋白的生物學(xué)功能未知，同源性也不高，但都有含有一個(gè)纖連蛋白III的功能域，推測(cè)該類蛋白的免疫保護(hù)性取決于構(gòu)象表位而非線性表位，重組蛋白因不容易保持穩(wěn)定的構(gòu)象而限制其推廣應(yīng)用，我們利用生物信息學(xué)對(duì) Ta18基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有FnIII功能域。
　　本研究在對(duì)

7、 Ta18基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上，從枯草桿菌基因組中擴(kuò)增芽孢衣殼蛋白CotC，將Ta18基因克隆入CotC結(jié)構(gòu)基因的下游，采用枯草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草桿菌 WB600并誘導(dǎo)芽孢生成，構(gòu)建Pus186-CotC-Ta18重組枯草芽孢工程菌。展開(kāi)對(duì) Ta18重組枯草芽孢的生物學(xué)特性研究，分析其所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答特征，對(duì)其免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)估，為搭建新型高效抗絳、囊蟲病口服疫苗平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。
　　2、目的和意

8、義：
　　以分類地位介于豬帶絳蟲和牛帶絳蟲的亞洲帶絳蟲作為突破點(diǎn)，充分發(fā)揮學(xué)科交叉優(yōu)勢(shì)，使用枯草芽孢桿菌作為表達(dá)載體，對(duì)亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因進(jìn)行原核表達(dá)，關(guān)于利用枯草芽孢表達(dá)帶絳蟲候選抗原基因至今未見(jiàn)報(bào)道，探索以芽孢型益生菌候選抗原遞送系統(tǒng)刺激抗亞洲帶絳蟲蟲卵感染的免疫特點(diǎn)，分析免疫應(yīng)答類型、強(qiáng)度、及對(duì)攻擊感染的保護(hù)效果。本項(xiàng)目擬從中間宿主入手，研制豬、牛用口服疫苗，切斷傳播途徑，從而達(dá)到預(yù)防絳、囊蟲病的目的。以帶絳蟲功能

9、基因組學(xué)研究為基礎(chǔ)，以新型原核表達(dá)平臺(tái)為手段，以實(shí)用化應(yīng)用成果為目標(biāo)，利用先進(jìn)的技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)研究成果的轉(zhuǎn)化。
　　3、方法：
　　3.1亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的生物信息學(xué)分析及重組枯草芽孢工程菌的構(gòu)建
　　3.1.1亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因生物信息學(xué)分析
　　利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI網(wǎng)站的BLASTx對(duì)測(cè)序所得核酸序列進(jìn)行分析，用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASY）提供

10、的生物信息學(xué)工具對(duì)Ta18基因所編碼蛋白的功能和特性進(jìn)行預(yù)測(cè)。ProtParam分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。
　　3.1.2亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的克隆、表達(dá)
　　鑒定亞洲帶絳蟲成蟲，孵化蟲卵，提取六鉤蚴總RNA并合成cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增六鉤蚴Ta18基因，鑒定pET-28a(+)-Ta18重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)Ta18重組蛋白，大量表達(dá)并純化，獲得純化蛋白，測(cè)定蛋白濃度。
　　3.1.3 Ta18重組蛋白抗血清制備

11、
　　使用純化的Ta18重組蛋白皮下注射免疫大鼠，獲得Ta18特異性抗血清。
　　3.1.4 Ta18的免疫原性和免疫反應(yīng)性分析
　　用制備的Ta18重組蛋白抗血清，Western Blotting方法檢測(cè)Ta18重組蛋白的免疫原性及免疫反應(yīng)性。
　　3.1.3亞洲帶絳蟲六鉤蚴 Ta18重組枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建
　　提取枯草桿菌基因組 DNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增芽孢外殼蛋白 CotC，目的基因 CotC和Ta

12、18與質(zhì)粒 Pus186連接，轉(zhuǎn)化枯草桿菌 WB600原生質(zhì)體，構(gòu)建并鑒定Pus186-CotC-Ta18融合表達(dá)載體，誘導(dǎo)芽孢生成，收集、定量芽孢，提取芽孢外殼蛋白并檢測(cè)。Western Blotting方法檢測(cè)Ta18重組枯草芽孢的免疫反應(yīng)性。
　　3.2 Ta18重組枯草芽孢的生物學(xué)特性研究
　　3.2.1Ta18重組枯草芽孢的抗性評(píng)估
　　配置模擬胃液和腸液，調(diào)節(jié)好pH值。將離心后的菌液重懸于模擬胃、腸液中，鋪

13、板，計(jì)數(shù)。
　　3.2.2重組芽孢表面Ta18的免疫熒光、流式細(xì)胞儀檢測(cè)
　　以大鼠抗Ta18重組蛋白的免疫血清為一抗，熒光標(biāo)記抗大鼠IgG為二抗，檢測(cè)目的蛋白在芽孢表面的表達(dá)，同時(shí)，對(duì)重組芽孢進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　3.2.3 Ta18在亞洲帶絳蟲的組織定位及階段表達(dá)研究
　　以大鼠抗Ta18重組蛋白的免疫血清為一抗，以綠色熒光標(biāo)記的抗大鼠IgG為二抗，檢測(cè) Ta18基因在亞洲帶絳蟲成蟲、蟲卵及囊尾蚴的組織定

14、位，并在熒光顯微鏡下觀察、拍照。分別以亞洲帶絳蟲成蟲頭節(jié)cDNA文庫(kù)、成蟲成節(jié)cDNA、成蟲孕節(jié)cDNA及囊尾蚴cDNA文庫(kù)為模板，用合成引物擴(kuò)增，進(jìn)行階段表達(dá)分析。
　　3.3 Ta18重組枯草芽孢免疫保護(hù)性效果評(píng)估
　　3.3.1 Ta18重組枯草芽孢口服免疫家豬血清中IgG及糞便中IgA的含量變化研究
　　設(shè)Pus186-CotC-Ta18芽孢組、Pus186-CotC芽孢組及常規(guī)感染組，口服免疫家豬，定期收集血

15、清和糞便，ELISA法檢測(cè)血清中IgG及糞便中IgA的含量變化。
　　3.3.2抗Ta18多抗對(duì)亞洲帶絳蟲六鉤蚴體外作用
　　分離亞洲帶絳蟲蟲卵，體外孵化六鉤蚴，實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行體外殺傷六鉤蚴實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3.3.3 Ta18重組枯草芽孢口服疫苗免疫保護(hù)性效果研究
　　3.3.3.1蟲卵攻擊感染實(shí)驗(yàn)
　　分三組：重組枯草芽孢組（Pus186-CotC-Ta18）、空載體枯草芽孢組（Pus186-Co

16、tC）和常規(guī)感染組（用生理鹽水處理）口服免疫家豬后，用亞洲帶絳蟲蟲卵攻擊，于30、40天，處死家豬，仔細(xì)檢查家豬體內(nèi)囊尾蚴寄生情況，計(jì)數(shù)蟲荷。
　　3.3.4實(shí)驗(yàn)感染家豬肝臟的病理學(xué)變化
　　取各感染豬肝臟組織分別置于10%甲醛內(nèi)固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，H. E.染色,鏡檢。
　　4、結(jié)果：
　　4.1亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18的生物信息學(xué)分析及重組枯草芽孢工程菌的構(gòu)建
　　4.1.1 Ta18基因生物信息學(xué)

17、分析
　　生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Ta18基因序列與GenBank中的牛帶絳蟲18kD蛋白的一致性達(dá)99%；與豬帶絳蟲一致性達(dá)97%，包含完整的開(kāi)放閱讀框，為全長(zhǎng)cDNA序列，序列長(zhǎng)度為396bp，編碼131個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)Ta18蛋白質(zhì)的理論分子量為14810.4 Da；等電點(diǎn)為10.05，其他理化性質(zhì)均較穩(wěn)定。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該基因含有一信號(hào)肽序列，蛋白翻譯后結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在30-117位氨基酸處含有一個(gè)絳蟲屬18kD基因共有的纖

18、連蛋白FnⅢ型結(jié)構(gòu)域。
　　4.1.2亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的克隆、表達(dá)
　　成功從亞洲帶絳蟲六鉤蚴中擴(kuò)增出Ta18基因，并克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)上，通過(guò)雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET28a(+)-Ta18構(gòu)建成功。表達(dá)重組質(zhì)粒并獲得純化蛋白。Western Blotting分析結(jié)果表明，重組Ta18純化蛋白能被重組蛋白免疫的SD大鼠血清識(shí)別，具有較好的免疫原性；同時(shí)也能被帶絳蟲病患者血清識(shí)別

19、，說(shuō)明重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。
　　4.1.3 Ta18重組枯草芽孢工程菌的構(gòu)建
　　提取枯草桿菌基因組，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增出芽孢外殼蛋白CotC，將Ta18基因克隆入CotC結(jié)構(gòu)基因的下游，構(gòu)建Pus186-CotC-Ta18重組質(zhì)粒，采用枯草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將 Pus186-CotC-Ta18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草桿菌 WB600，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆的篩選，用耗竭法使CotC-Ta18融合表達(dá)在芽孢表面，每升DSM液體培養(yǎng)所生成

20、芽孢達(dá)1×1011。重組枯草芽孢表達(dá)的融合蛋白能被制備的抗血清識(shí)別。
　　4.2 Ta18重組枯草芽孢的生物學(xué)特性研究
　　4.2.1 Ta18重組枯草芽孢的抗性評(píng)估
　　Ta18重組枯草芽孢在模擬胃、腸環(huán)境中具有較高的耐受力和存活率，表明芽孢能耐受極端環(huán)境，能順利通過(guò)胃環(huán)境，到達(dá)腸道。
　　4.2.2 Ta18在亞洲帶絳蟲的組織定位及階段表達(dá)研究
　　免疫熒光組織定位結(jié)果顯示 Ta18定位于成蟲的表膜、蟲

21、卵的胚膜、囊尾蚴的體壁上。來(lái)自六鉤蚴的Ta18基因，在成蟲的頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)以及囊尾蚴階段均有表達(dá)。
　　4.2.3亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18重組枯草芽孢的免疫熒光定位及流式細(xì)胞儀檢測(cè)
　　以大鼠抗Ta18重組蛋白的免疫血清為一抗，熒光標(biāo)記抗大鼠（FITG標(biāo)記）為二抗Pus186-CotC-Ta18重組芽孢表面可見(jiàn)綠色熒光。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到Ta18重組枯草芽孢（Pus186-CotC-Ta18）有強(qiáng)熒光峰。
　　4.3

22、Ta18重組枯草芽孢免疫保護(hù)性效果評(píng)估
　　4.3.1 Ta18重組枯草芽孢口服免疫家豬血清中IgG及糞便中IgA的含量變化研究
　　糞便中特異性IgA水平顯著高于非重組芽孢處理組及常規(guī)感染組，但血清IgG升高不明顯。
　　4.3.2抗Ta18多抗對(duì)亞洲帶絳蟲六鉤蚴體外作用
　　體外培養(yǎng)4d后，抗Ta18多抗與對(duì)照組比較，殺蟲率差異顯著（P<0.05）。
　　4.3.3 Ta18重組枯草芽孢口服疫苗免疫保護(hù)

23、性效果研究
　　4.3.3.1蟲卵攻擊感染實(shí)驗(yàn)
　　在蟲卵攻擊后的第30、40天，可觀察到常規(guī)感染組和Pus186-CotC組家豬肝臟上囊尾蚴數(shù)量明顯多于Pus186-CotC-Ta18組，減蟲率可達(dá)到75.4%。
　　4.3.4感染家豬肝臟的病理學(xué)變化
　　囊尾蚴周圍的肝細(xì)胞可見(jiàn)水腫,空泡變性，組織內(nèi)較多嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，囊尾蚴周圍組織表現(xiàn)為肉芽腫性炎。Ta18重組芽孢免疫組、CotC芽孢免

24、疫組與常規(guī)感染組囊尾蚴所致家豬肝臟病理變化未見(jiàn)明顯差異。
　　5、結(jié)論：
　　5.1首次根據(jù)已知的豬、牛帶絳蟲六鉤蚴18kD基因序列克隆出亞洲帶絳蟲六鉤蚴18kD基因。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示Ta18包含完整的開(kāi)放閱讀框，序列長(zhǎng)度為396bp，編碼131個(gè)氨基酸。有一信號(hào)肽序列和纖連蛋白FnⅢ型功能結(jié)構(gòu)域。
　　5.2對(duì)Ta18基因進(jìn)行克隆表達(dá)，獲得純化蛋白。重組Ta18純化蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可以作為潛在的

25、疫苗候選分子。但不適合作為特異的絳、囊蟲病診斷抗原。
　　5.3 Ta18定位于成蟲的表膜、蟲卵的胚膜和囊尾蚴的體壁上。Ta18在亞洲帶絳蟲卵、成蟲的頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)以及囊尾蚴階段均有表達(dá)。進(jìn)一步證明了 Ta18基因是疫苗候選分子。
　　5.4成功構(gòu)建 Pus186-CotC-Ta18重組枯草芽孢工程菌，采用枯草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將Pus186-CotC-Ta18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草桿菌WB600，免疫熒光定位及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

26、顯示CotC-Ta18融合表達(dá)在芽孢表面。
　　5.5枯草芽孢在模擬胃、腸環(huán)境中具有較高的耐受力和存活率。
　　5.6免疫保護(hù)性效果研究顯示：1）、體外殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗Ta18血清中存在針對(duì)六鉤蚴的保護(hù)性抗體；2）、重組芽孢口服免疫家豬，糞便特異性IgA水平顯著高于對(duì)照組，血清IgG也有升高，但變化不明顯，說(shuō)明重組枯草芽孢能發(fā)揮免疫佐劑作用，活化腸粘膜上的相關(guān)淋巴組織，使SIgA抗體分泌增強(qiáng)；3）、Ta18重組枯草芽孢的減蟲率