亞洲帶絳蟲六鉤蚴Ta18基因的克隆、表達(dá)及其芽孢益生菌型飼料添加劑的初步研制.pdf

1、目的：從亞洲帶絳蟲（Taenia asiatica）六鉤蚴cDNA文庫中克隆出Ta18基因（亞洲帶絳蟲六鉤蚴18kDa基因），分析預(yù)測其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，對其進(jìn)行克隆表達(dá)、免疫學(xué)特性分析，構(gòu)建重組Ta18枯草芽孢工程菌并對枯草芽孢益生菌型飼料添加劑進(jìn)行初步研制。
　　方法：用RT-PCR方法從亞洲帶絳蟲六鉤蚴cDNA中獲取Ta18基因，通過測序獲得目的基因序列，利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)、瑞士生物信息學(xué)研究

2、所的蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASy）中有關(guān)的生物信息學(xué)分析工具，結(jié)合其它生物信息學(xué)分析軟件包，預(yù)測、分析基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。將Ta18基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+)中，在大腸桿菌 BL-21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后用以免疫SD大鼠制備免疫血清。用蛋白印跡（Western Blotting）方法初步分析純化的重組蛋白的免疫學(xué)特性。用RT-PCR方法從亞洲帶絳蟲蟲卵、成蟲不同部位的cDNA中檢測Ta

3、18基因的表達(dá)情況。使用枯草芽孢外殼主要成分CotC作為融合蛋白啟動子，構(gòu)建 Pus186-CotC-Ta18融合表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入枯草桿菌WB600。使用DSM(Difco Sporulation Medium)培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽孢生成，36h后收集芽孢。提取芽孢外殼蛋白。使用Ta18抗血清，蛋白印跡驗(yàn)證外源蛋白在重組芽孢表面的表達(dá)。
　　結(jié)果：成功克隆出Ta18基因，全長396bp，編碼131個氨基酸，其序列包含完整開放閱讀框，推導(dǎo)出

4、的氨基酸序列與GenBank中牛帶絳蟲18kD蛋白的同源性最高，一致性達(dá)99％，與豬帶絳蟲一致性達(dá)97%。蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定，MotifScan分析顯示 Ta18含有纖連蛋白 FnⅢ型結(jié)構(gòu)域。PCR、雙酶切及DNA測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ta18構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌 BL-21/DE3中獲得可溶性表達(dá)，經(jīng)親和層析獲得了高純度蛋白。重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別，具有免疫原性；同時(shí)重

5、組蛋白也能被亞洲帶絳蟲病患者、豬帶絳蟲患者和牛帶絳蟲患者血清識別，具有較好的免疫反應(yīng)性。研究還發(fā)現(xiàn)Ta18基因在亞洲帶絳蟲成蟲的頭節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)中都有表達(dá)。成功構(gòu)建了 Pus186-CotC-Ta18融合表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入枯草桿菌WB600，DSM培養(yǎng)基培養(yǎng)36h誘導(dǎo)芽孢生成，提取芽孢外殼蛋白行15%SDS-PAGE，結(jié)果表明目的基因在芽孢表面高效表達(dá)，芽孢外殼蛋白能被重組蛋白Ta18免疫的SD大鼠血清識別，具有免疫原性。
　　結(jié)論