交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨的構(gòu)建與生物學(xué)特性的研究.pdf

1、研究目的:
　　 骨關(guān)節(jié)結(jié)核是肺外結(jié)核中最常見(jiàn)的一種，近年來(lái)發(fā)病率有明顯回升的趨勢(shì)。根據(jù)調(diào)查研究，全世界現(xiàn)有的結(jié)核病人大約有2000萬(wàn)人，我國(guó)目前的結(jié)核病人數(shù)占全球的第二位，大約有500萬(wàn)人左右。在這些結(jié)核病患者中，患有骨結(jié)核和骨關(guān)節(jié)結(jié)核的病人約占總?cè)藬?shù)的1％-2％。
　　 在傳統(tǒng)骨結(jié)核的治療中我們往往采用全身早期、規(guī)律、全程、聯(lián)合、適量的原則進(jìn)行藥物治療。病灶清除手術(shù)去除感染壞死組織是局部治療的重要手段，骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者

2、行感染病灶清除術(shù)后主要依靠全身抗結(jié)核藥物治療，往往術(shù)后也立即在病灶局部放置抗結(jié)核藥物來(lái)加強(qiáng)抗感染治療。不幸的是，由于全身抗結(jié)核藥物治療到達(dá)病灶局部的藥物濃度較低，甚至在血供不豐富的局部組織抗結(jié)核藥物根本無(wú)法到達(dá)，而局部給藥缺乏明確的用藥指導(dǎo)，常常是一種經(jīng)驗(yàn)性治療以至于給藥范圍不均勻、局部藥物濃度過(guò)大對(duì)正常骨細(xì)胞有毒性，加上術(shù)后骨缺損局部任然存在炎性病灶，結(jié)核分支桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物易產(chǎn)生耐藥性，這些都極大地增加了骨結(jié)核復(fù)發(fā)和骨缺損移植物修復(fù)

3、失敗的風(fēng)險(xiǎn)，最終增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，延長(zhǎng)康復(fù)時(shí)間。因此如何最大化降低術(shù)后局部結(jié)核病灶的復(fù)發(fā)以及促進(jìn)缺損骨組織的修復(fù)是當(dāng)前骨科醫(yī)生面臨的困境。目前臨床上對(duì)于結(jié)核病灶清除術(shù)后的骨組織缺損盡量采用自體骨移植或軟組織填塞并緩慢鈣化來(lái)治療，自體骨移植雖然生物相容性好，融合率高，但來(lái)源有限，而且由于局部炎癥反應(yīng)容易導(dǎo)致移植失敗；而異體骨、陶瓷、組織工程骨由于生物相容性的因素更易導(dǎo)致局部炎癥的加重，而且極易成為結(jié)核桿菌的寄存地。另外，感染病灶

4、清除術(shù)后骨組織缺損局部區(qū)域仍存在炎癥反應(yīng)，而且由于結(jié)核桿菌抗結(jié)核藥物的抵抗能力強(qiáng)，往往需要長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)給藥才能殺滅結(jié)核桿菌或抑制其生長(zhǎng)。因此理想的治療策略就是設(shè)計(jì)具有促進(jìn)骨缺損組織修復(fù)作用并且同時(shí)可以長(zhǎng)效緩釋抗結(jié)核藥物的人工骨填充緩釋材料，這樣就可以在促進(jìn)骨組織再生修復(fù)骨缺損的同時(shí)維持局部有效的抗結(jié)核藥物濃度，有助于骨移植物周?chē)墙M織再生同時(shí)抑制局部結(jié)核桿菌的繁殖，從而避免局部結(jié)核病灶的復(fù)發(fā)，促進(jìn)患者的康復(fù)。
　　 在目前局部抗結(jié)

5、核藥物載體的研究中，比較多見(jiàn)的是高分子有機(jī)材料和無(wú)機(jī)材料，但通常的無(wú)機(jī)材料雖然機(jī)械強(qiáng)度大，化學(xué)穩(wěn)定性好但其制備過(guò)程中常常需要高溫高壓的條件，從而使抗結(jié)核藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗藥性受到不同程度的影響，而且目前尚未有負(fù)載抗結(jié)核藥后長(zhǎng)時(shí)間緩釋的研究和報(bào)道，因此無(wú)機(jī)物抗結(jié)核藥物載體還需進(jìn)一步探索和研究。
　　 海藻酸鈉(SA)是一種來(lái)源于褐藻類(lèi)的天然有機(jī)高分子化合物，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性。它在鈣離子的作用下可誘

6、導(dǎo)產(chǎn)生自組裝行為，將抗結(jié)核藥物與其按一定濃度在氯化鈣溶液中混合后可形成控釋的海藻酸鈉抗結(jié)核藥物微球，由于其溫和的溶膠凝膠過(guò)程、良好的生物相容性使它適合作為釋放和包埋藥物、蛋白與細(xì)胞的載體。
　　 聚乳酸及其共聚物(PLA/PLGA/PCL)是一種典型的合成類(lèi)可完全降解的高分子有機(jī)材料，其降解速率還與組織細(xì)胞的生長(zhǎng)速率相適應(yīng)，而且降解產(chǎn)物可參加體內(nèi)循環(huán)，最終以二氧化碳和水的形式排出體外，對(duì)機(jī)體和環(huán)境無(wú)害，因此具有可靠的生物安全性，

7、并且其具有良好的生物力學(xué)性能及易于加工成型等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于生物醫(yī)用材料中，同時(shí)也可作為一種較成熟的可降解生物涂層使用。
　　 人工骨支架材料的選擇上，考慮到抗結(jié)核藥物緩釋微球的結(jié)合和后期動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們選擇磷酸三鈣生物陶瓷(TPB)這一在臨床上被廣泛應(yīng)用的成熟的骨替代支架材料。
　　 利福平(RFP)是一種半合成抗生素，具有廣譜抗菌作用，也是抗結(jié)核首選藥物之一，通常在臨床上與其他幾種抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用具有良好的抗

8、癆效果。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)擬將人工骨支架(TPB)與一定濃度的海藻酸鈉(SA)、氯化鈣水溶液、抗結(jié)核藥(RFP)相混合，利用海藻酸鈉在鈣離子作用下的自組裝特性制備成人工骨支架/海藻酸鈉抗結(jié)核藥物微球復(fù)合體(TPB/SA-RFP)，并將此復(fù)合體分別用聚乳酸及其共聚物(PLA/PLGA/PCL)表面涂層化處理，從而最終制備出交聯(lián)可調(diào)式抗結(jié)核藥物緩釋型納米人工骨復(fù)合體(TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL)。而后觀測(cè)復(fù)

9、合體的微觀結(jié)構(gòu)、通過(guò)體外測(cè)定復(fù)合體的緩釋特性進(jìn)而確定在制備TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體時(shí)最佳海藻酸鈉/氯化鈣質(zhì)量百分比、最佳利福平濃度、通過(guò)體外細(xì)胞毒性測(cè)定確定最佳聚乳酸類(lèi)緩釋涂層材料，然后在動(dòng)物體內(nèi)測(cè)定TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體的毒性、血藥濃度以及成骨效應(yīng)等一系列理化性質(zhì)，從而為最終能實(shí)際應(yīng)用于臨床中提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。
　　 研究方法:
　　 1：TPB/SA-R

10、FP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體的制備，以及復(fù)合體形態(tài)結(jié)構(gòu)，藥物緩釋特性、細(xì)胞毒性的檢測(cè)。方法：以TPB(磷酸三鈣生物陶瓷)和利福平為原材料，將其浸沒(méi)于一定濃度的海藻酸鈉/氯化鈣利福平水溶液中；通過(guò)海藻酸鈉與鈣離子的凝膠化作用，將負(fù)載的利福平包封在磷酸三鈣生物陶瓷內(nèi)制備成TPB/SA-RFP抗結(jié)核藥物微球復(fù)合體，然后將此復(fù)合體分別浸沒(méi)于一定濃度的PLA/PLGA/PCL溶液中，最后取出干燥、去除溶劑，從而最終制備出TPB/SA-RF

11、P/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體。在掃描電鏡下觀測(cè)晶相組成、微觀形貌。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定利福平在不同濃度的海藻酸/氯化鈣水溶液中的緩釋效能，來(lái)確定最佳海藻酸鈉/氯化鈣質(zhì)量百分比。測(cè)定不同濃度的利福平在海藻酸鈉/氯化鈣水溶液中的誘導(dǎo)效率(EE)和負(fù)載效率(LE)來(lái)確定最佳的利福平濃度。分別測(cè)定體外利福平在TPB/SA-RFP/PLA，TPB/SA-RFP/PLGA，TPB/SA-RFP/PCL復(fù)合體中的緩釋時(shí)間，來(lái)確定哪一種聚乳酸類(lèi)緩

12、釋涂層材料的緩釋時(shí)間最長(zhǎng)。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，以MC-3T3為試驗(yàn)細(xì)胞，分別測(cè)定空白組(單純TPB)、陽(yáng)性組(RFP直接給藥)、實(shí)驗(yàn)組TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL，復(fù)合體對(duì)MC-3T3的毒性，進(jìn)一步確定TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體是否具有可靠的生物安全性，以及最佳的聚乳酸類(lèi)緩釋涂層材料。
　　 2：TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。方法：以新西蘭大白兔為試

13、驗(yàn)動(dòng)物，分組建立兔股骨骨缺損模型，將TPB/SA-RFP/PLA、TPB/SA-RFP/PLGA復(fù)合體作為實(shí)驗(yàn)組，將TPB作為空白對(duì)照組植入缺損部位，術(shù)后監(jiān)測(cè)其生命體征、傷口愈合及肢體活動(dòng)情況。在術(shù)后1天、3天、5天、7天、14天、28天、42天對(duì)靜脈血標(biāo)本進(jìn)行血藥濃度的測(cè)定，分批在4周、8周、12周空氣注射法處死并取出股骨大體標(biāo)本，對(duì)大體標(biāo)本進(jìn)行X光掃描、固定后組織染色和免疫組化定性分析，進(jìn)而確定抗結(jié)核藥在該復(fù)合體植入體內(nèi)后的血藥濃度

14、變化以及成骨誘導(dǎo)性能。
　　 結(jié)果:
　　 1、TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體呈多孔結(jié)構(gòu)、大小均勻、排列有序，有較低的結(jié)晶度在體內(nèi)更易降解，該材料具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性。制備TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體時(shí)最佳的海藻酸鈉/氯化鈣質(zhì)量百分比是1％，最佳利福平濃度是1mg/mL，聚乳酸類(lèi)緩釋涂層材料中PLA最優(yōu)，PCL與PLGA無(wú)明顯差異，RFP在TPB/SA-RFP/PLA-PLG

15、A-PCL復(fù)合體外緩釋時(shí)間>30天、緩釋濃度>MIC值。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示海藻酸鈉/聚乳酸類(lèi)涂層材料無(wú)毒性，生物相容性好，并且能明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的早期粘附、增殖以及晚期增殖的作用(P<0.01)。
　　 2、TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RFP在TPB/SA-RFP/PLA復(fù)合體植入動(dòng)物體內(nèi)42天后任維持一定的有效血藥濃度，TPB/SA-RFP/PLA、TPB/SA-RFP/

16、PLGA復(fù)合體對(duì)成骨作用明顯，海藻酸鈉/聚乳酸類(lèi)材料的加入對(duì)TPB骨支架材料的成骨性能未有明顯的抑制和破壞作用，TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體材料具有明顯的骨重建和充填功能，有望被用來(lái)重建骨結(jié)核病灶清除后的骨缺損殘腔。
　　 結(jié)論:
　　 TPB/SA-RFP/PLA-PLGA-PCL復(fù)合體實(shí)驗(yàn)室合成方便，載藥量大，包封率高，體外試驗(yàn)結(jié)果表明其緩釋性能良好，緩釋時(shí)間較長(zhǎng)，療效明顯，TPB/SA-RF