用于核移植表達(dá)rHSA嵌合HLA-YAC的山羊胎兒成纖維細(xì)胞株的制備.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要用于基因功能研究、人類(lèi)遺傳病動(dòng)物模型以及在乳汁中表達(dá)重組蛋白,然而常規(guī)載體轉(zhuǎn)基因由于受整合位點(diǎn)以及構(gòu)件本身缺陷的影響,表達(dá)的不確定性是其主要缺陷,解決的主要途徑之一就是利用具有獨(dú)立表達(dá)域的基因組大片斷作為表達(dá)框架來(lái)排除位置效應(yīng).酵母人工染色體(YAC)巨大的克隆能力能滿(mǎn)足這個(gè)要求,YAC克隆(YACs)轉(zhuǎn)基因在大部分情況下表現(xiàn)出了位置獨(dú)立性、拷貝數(shù)依賴(lài)性、組織特異性以及與內(nèi)源性基因相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平.本實(shí)驗(yàn)利用從法國(guó)人類(lèi)多態(tài)性

2、研究中心(CEPH)YAC庫(kù)篩選出的含人α-乳白蛋白基因(human α-lactalbumin gene,hα-Lac)的長(zhǎng)約210kb的YAC(HLA-YAC),用于在轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中表達(dá)人血清白蛋白(human serum albumin,HSA).CEPH YAC庫(kù)是用酵母AB1380菌株構(gòu)建的,該菌株缺少可用的遺傳篩選標(biāo)記,這給YACs的遺傳學(xué)操作帶來(lái)了難度.為了便于同源重組的篩選,借助YPH925的kar1突變,使YPH92

3、5菌株與異交配型菌株交配時(shí)喪失核融合的能力,通過(guò)單個(gè)染色體在酵母間的轉(zhuǎn)移,在藥物篩選的條件下,把HLA-YAC由酵母AB1380轉(zhuǎn)移到his3缺陷的YPH925菌株,經(jīng)脈沖凝膠電泳和PCR方法證實(shí),YPH925獲得了來(lái)自AB1380的HLA-YAC.為了探索用不同的篩選標(biāo)記在酵母中對(duì)HLA-YAC定點(diǎn)打靶的可行性,構(gòu)建了包含HIS3(對(duì)YPH925菌株)和G418R(對(duì)YPH925和AB1380兩種菌株)兩個(gè)篩選標(biāo)記,以及hα-Lac的