體細胞核移植胚胎和皮膚成纖維細胞來源干細胞的相關技術研究.pdf

1、目的：⑴研究不同核移植方法對小鼠體細胞核移植效率的影響，建立一種簡單有效的核移植方法。⑵探討單一和聯(lián)合化學激活方法對小鼠體細胞核移植胚胎體外發(fā)育的影響。⑶比較一步法和二步法兩種培養(yǎng)系統(tǒng)對小鼠體細胞核移植胚胎體外發(fā)育的影響，確立一種有效的培養(yǎng)系統(tǒng)。⑷利用微衛(wèi)星DNA技術進行體細胞核移植囊胚的鑒定。⑸探討小鼠體細胞核移植胚胎ES細胞樣集落分離和培養(yǎng)方法，比較不同因子對建立核移植胚胎ES細胞樣集落效率的影響。⑹體外誘導小鼠成纖維細胞重編程為多

2、能胚胎干細胞樣集落。 方法：⑴以小鼠顆粒細胞作為體細胞核移植的供核細胞，采用四種去核方法(盲吸法、蔗糖輔助去核法、化學去核法、熒光染色去核法)研究卵母細胞去核率的差異，并比較了胞質內注射法和反向核移植法應用于小鼠體細胞核移植的效果。⑵構建小鼠核移植胚胎。分別使用單一激活劑鈣離子載體(A23187)、乙醇(Eth)、氯化鍶(SrCl2)及聯(lián)合蛋白激酶抑制劑6-DMAP、CB激活。⑶構建小鼠核移植胚胎。激活后，隨機分為兩組。第1組，

3、比較核移植胚胎在KSOMgAA，KSOMgAA/KSOMgAA，cleavage medium andcleavage medium/blastocyst medium中的發(fā)育情況；第2組，觀察牛黃酸對核移植胚胎發(fā)育影響。⑷提取近交系小鼠體細胞核移植囊胚、供體BALB/c小鼠、受體C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因組DNA，使用巢式聚合酶鏈反應擴增4個微衛(wèi)星位點DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14

4、Mit50。⑸構建小鼠體細胞核移植胚胎。當核移植胚胎培養(yǎng)至早期囊胚階段，移至小鼠胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上，換成ES細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4～5d，分離消化ICM，重新接種。2 d后分離出ES樣細胞集落，進行形態(tài)學觀察。⑹分別將Pou5f1，Sox2，c-Myc和Klf4真核表達載體轉染NIH3T3細胞。分離小鼠成纖維細胞，移至小鼠胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上，取轉染后的上清液培養(yǎng)。3d后，加入G418，篩選克隆2～3w。 結果：⑴熒光染色法

5、的去核率(88％)顯著高于其他試驗組(P<0.05)；胞質內注射法的囊胚率和囊胚細胞數(shù)較反向核移植高(P<0.05)。⑵10mmol/L SrCl2處理6 d可獲得較高卵裂率(68.9％)和囊胚率(7.2％)(P<0.05)，也較A23187、Eth組高(P<0.05)；聯(lián)合激活方法中，Eth+6-DMAP+CB組(69.8％和46.05±2.62)、SrCl2+CB組(71.9％和45.40±2.23)和A23187+6-DMAP+C

6、B組(62％和39.75±1.15)卵裂率和囊胚細胞計數(shù)明顯高于未聯(lián)合組(P<0.05)。⑶核移植胚胎發(fā)育的囊胚率、孵化率和囊胚細胞計數(shù)一步法和兩步法培養(yǎng)體系中沒有顯著差異(P>0.05)。?；撬峒尤隟SOMgAA后能有效改善早期核移植胚胎體外發(fā)育能力。⑷通過微衛(wèi)星DNA序列的擴增，證明核移植囊胚的微衛(wèi)星DNA與供體細胞完全相同，而與受體細胞或者對照細胞無親緣關系。⑸ ES樣細胞集落具有典型的形態(tài)學特征：集落呈鳥巢狀，邊緣清楚，表面平滑

7、，結構致密，隆起生長，細胞之間界限不清楚；單個細胞體積小、核大。堿性磷酸酶染色呈陽性。體外可分化為擬胚體，體內可分化成上皮樣細胞、腺體和肌肉組織。⑹篩選初期大部分克隆形態(tài)學為扁平狀，僅4株克隆為ES細胞樣生長，后期克隆數(shù)增長至11株。ES細胞樣克隆具有島嶼狀團狀隆起結構。 結論：⑴熒光染色去核法和胞質內注射法構建體細胞核移植胚胎效率較高，可維持胚胎早期發(fā)育。⑵乙醇聯(lián)合6-DMAP、CB組合，SrCl2聯(lián)合CB組合均能較好地激活小