牛體細(xì)胞核移植方法的研究.pdf

1、體細(xì)胞核移植的成功在理論上證明了哺乳動(dòng)物的分化細(xì)胞仍具有全能性，同時(shí)也為快速擴(kuò)增瀕危滅絕動(dòng)物等提供了新途徑?？寺?dòng)物的核移植受眾多因素影響，其中供體細(xì)胞核的獲得是重要的環(huán)節(jié)之一。目前運(yùn)用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射法進(jìn)行核移植時(shí)，供體細(xì)胞必須完全破膜，因而有必要尋求一種簡便可行的方法。本研究旨在以牛脾臟細(xì)胞為抗原，制備兔抗牛脾臟細(xì)胞多克隆抗體，通過免疫外科法裂解供體細(xì)胞膜，獲得破膜的核胞體，進(jìn)而應(yīng)用于體細(xì)胞核移植的胞質(zhì)內(nèi)注射，從而為體細(xì)胞核移植供體細(xì)胞

2、核的獲得提供一種新的思路。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴比較國產(chǎn)激素(FSH，LH)不同添加量對牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明，國產(chǎn)激素完全可以滿足牛卵母細(xì)胞體外成熟的需要。當(dāng)FSH與LH的劑量分別為10μg/mL和20μg/mL時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟率達(dá)到最高值82.1%；這表明，牛卵母細(xì)胞體外成熟的最佳激素添加劑量組合為FSH:10μg/mL，LH:20μg/mL。
　　 ⑵牛卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)液中添加10%的BFF，

3、比較BFF存在與否對卵母細(xì)胞成熟的影響。結(jié)果表明，添加與不添加BFF的成熟率(83.2% versus82.1%)差異不顯著。
　　 ⑶成熟培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞用ionomycin+6-DMAP±CB和乙醇+6-DMAP±CB進(jìn)行激活處理，比較孤雌發(fā)育效果。結(jié)果表明：在ionomycin+6-DMAP±CB處理組中，兩組之間的孤雌激活卵裂率(83.3% versus79.0%)和囊胚率(37.3% versus35.9%)都沒有顯著

4、差異；而在乙醇+6-DMAP±CB處理組中，兩組之間的卵裂率(82.1% versus67.5%)和囊胚率(36.2%versus25.0%)都存在顯著性差異。但ionomycin+6-DMAP+CB和乙醇+6-DMAP+CB在卵裂率(83.3% versus82.1%)和囊胚率(37.3% versus36.2%)上卻沒有顯著性差異。這表明，ionomycin+6-DMAP±CB以及乙醇+6-DMAP±CB都可以有效地激活牛卵母細(xì)胞。

5、
　　 ⑷激活后的卵母細(xì)胞在SOFaa液中繼續(xù)培養(yǎng)，比較換液與不換液處理對牛孤雌激活囊胚率的影響。結(jié)果表明：更換與不更換培養(yǎng)液在孤雌囊胚率之間(39.7% versus33.9%)沒有顯著性差異。這表明，牛卵母細(xì)胞孤雌激活胚在大體積(500μL)的發(fā)育液中進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)時(shí)，換液與不換液對囊胚率并不會(huì)產(chǎn)生很大的影響。
　　 ⑸將成熟培養(yǎng)后的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體去卵丘，然后收集所得顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)的方法簡單易行，污染幾率小，

6、而且原代培養(yǎng)所需時(shí)間短，是顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)的理想方法。牛耳皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)液氮超低溫冷凍，采用快速解凍法(38℃，1～2 min)進(jìn)行解凍處理，細(xì)胞貼壁情況較好。以DMSO為冷凍保護(hù)劑，手工分段降溫冷凍法對牛顆粒細(xì)胞以及耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存是切實(shí)可行的。
　　 ⑹第10代對數(shù)生長期牛顆粒細(xì)胞中期相染色體組型分析表明，體外培養(yǎng)的牛顆粒細(xì)胞傳至第10代時(shí)，染色體為正常二倍體的比例為75.56%，可用于核移植重構(gòu)胚的構(gòu)建。

7、>　　 ⑺以牛脾臟細(xì)胞為抗原，兔耳靜脈注射進(jìn)行免疫，制備兔抗牛脾臟細(xì)胞多克隆抗體，抗血清效價(jià)測定結(jié)果顯示，血清抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期要求，稀釋比例達(dá)到1/64時(shí)，紅細(xì)胞仍有溶解反應(yīng)。將兔抗牛脾細(xì)胞多克隆抗體與供體細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)果顯示，抗血清可以成功的裂解供體細(xì)胞而獲得核胞體，這表明，免疫外科法裂解供體細(xì)胞膜獲得核胞體是切實(shí)可行的。
　　 ⑻分別以分離培養(yǎng)的牛顆粒細(xì)胞和耳成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞進(jìn)行核移植，比較不同核供體細(xì)胞對核移植效果的

8、影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞與耳成纖維細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚48h的卵裂率分別為62.62%和67.89%，沒有顯著差異，囊胚率(23.88% versus18.92%)也無顯著差異。這說明顆粒細(xì)胞和耳成纖維細(xì)胞都可以成功地構(gòu)建牛體細(xì)胞克隆胚。
　　 ⑼分別以牛顆粒細(xì)胞和耳成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，探討低溫冷藏供體細(xì)胞一定時(shí)間對核移植效果的影響。結(jié)果表明：顆粒細(xì)胞是否經(jīng)4℃低溫冷藏處理，克隆胚的卵裂率(63.34%versus62.03%)和

9、囊胚率(26.67% versus24.45%)都沒有顯著性差異；同樣，耳成纖維細(xì)胞是否經(jīng)4℃低溫冷藏，卵裂率(70.76% versus66.67%)和囊胚率(21.74% versus19.56%)也沒有顯著性差異。而且，顆粒細(xì)胞和耳成纖維細(xì)胞經(jīng)4℃低溫冷藏處理后，卵裂率(63.34% versus70.76%)和囊胚率(26.67% versus21.74%)均不存在顯著性差異。
　　 ⑽分別選擇在注核后1～3 h和3～5