水牛—牛異種體細(xì)胞核移植研究.pdf

1、異種體細(xì)胞核移植研究可以揭示不同動物之間細(xì)胞核質(zhì)互作的特征和規(guī)律，在實踐上可以使珍稀瀕危動物的快速繁育變得可行。本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)路線，對水牛f—牛異種體細(xì)胞核移植進(jìn)行了初步探索。重點從受體卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟時間、激活方法、供體細(xì)胞處理、胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)等幾個方面做了研究，建立了本實驗的體細(xì)胞核移植技術(shù)平臺；通過該平臺對水?！．惙N體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育的可能性進(jìn)行了探索性研究；并對水?！．惙N體細(xì)胞核移植早期胚胎發(fā)育效率與水牛、牛同種

2、體細(xì)胞核移植進(jìn)行了比較。 1、體細(xì)胞核移植技術(shù)平臺建立1)首先，本試驗利用牛卵母細(xì)胞孤雌激活的方法，比較了幾種不同的化學(xué)激活方法，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合激活方法比單一化學(xué)試劑激活方法效率高，而在聯(lián)合激活的方法中，Ionomycin+6-DMAP激活效率最好，其激活后8-細(xì)胞～桑椹胚發(fā)育率明顯高于EH+6-DMAP(22.0﹪vs.15.2﹪，p＜0.05)與A23187+6-DMAP(22.0﹪vs.9.8﹪，p＜0.05)。 2)其

3、次，比較了M199培養(yǎng)液和CR1aa培養(yǎng)液對牛孤雌胚的培養(yǎng)效果，結(jié)果表明CR1aa培養(yǎng)液比M199培養(yǎng)液更適合牛胚胎的培養(yǎng)(21.7﹪vs.16.7﹪，P＜0.05)。 3)比較牛卵母細(xì)胞不同成熟時間對成熟率和去核率的影響，結(jié)果表明，牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)16～18h組的成熟率顯著低于體外培養(yǎng)19～21h(45.6﹪vs.60.8﹪，p＜0.05)和22～24h(45.6﹪vs.64.7﹪，p＜0.05)組。而卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)22～

4、24h組的去核率顯著低于體外培養(yǎng)16～18h(52.2﹪vs.80.6﹪，p＜0.05)與19～21h(52.2﹪vs.73.3﹪，p＜0.05)組。為了提高盲吸法核移植效率，本試驗選擇成熟培養(yǎng)20h的牛卵母細(xì)胞作為核受體。 4)然后，在供體細(xì)胞的處理上，本試驗以水牛顆粒細(xì)胞作為供體細(xì)胞，一部分長滿后進(jìn)行核移植試驗，一部分饑餓處理后進(jìn)行核移植試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨血清饑餓處理供體細(xì)胞對核移植效果沒有顯著影響(9.5﹪vs.11.5﹪

5、，p＞0.05)。 2、水牛顆粒細(xì)胞核移入牛去核卵母細(xì)胞質(zhì)的研究在建立了體細(xì)胞核移植技術(shù)基本平臺的基礎(chǔ)上，以水牛顆粒細(xì)胞作為供核體，牛去核成熟卵母細(xì)胞作為受體，通過胞質(zhì)內(nèi)直接注射方法進(jìn)行異種體細(xì)胞核移植，重構(gòu)胚能夠發(fā)育到8-細(xì)胞(12.9﹪)，說明牛去核卵母細(xì)胞質(zhì)能夠支持水牛顆粒細(xì)胞核的重新編程。 3、水?！．惙N體細(xì)胞核移植與水牛、牛同種體細(xì)胞核移植效率比較在相同條件下，對水?！．惙N體細(xì)胞核移植與水牛、牛同種體細(xì)胞核

6、移植效率進(jìn)行比較，水?！．惙N核移植胚與水牛同種核移植胚的分裂率差異不顯著(38.8﹪vs.37.8﹪，p＞0.05)，8-細(xì)胞發(fā)育率差異顯著(12.9﹪vs.3.1﹪，p＜0.05)；水?！．惙N核移植胚與牛同種核移植胚的分裂率(38.8﹪vs.39.6﹪，p＞0.05)和8-細(xì)胞發(fā)育率(12.9﹪vs13.1﹪，p＞0.05)均無顯著差異。 結(jié)論：在本研究體系中，水牛—牛異種體細(xì)胞核移植胚胎能夠在體外培養(yǎng)條件下正常發(fā)育到8-

7、細(xì)胞；水?！．惙N體細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育能力略低于牛同種體細(xì)胞核移植(p＞0.05)，但是顯著高于水牛同種體細(xì)胞核移植(p＜0.05)。試驗證明，將水牛顆粒細(xì)胞核移入牛去核卵母細(xì)胞內(nèi)，該異種核能夠發(fā)育至8-細(xì)胞早期胚胎發(fā)育階段，但沒有越過牛種早期胚胎8～16-細(xì)胞的阻滯期階段。綜上所述，本實驗室所建立的牛核移植的去核、移核、激活、重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和供體細(xì)胞的處理體系有利于牛去核卵母細(xì)胞受體構(gòu)建同種和異種核移植胚胎的早期發(fā)育(同種核移植8