莆田黑豬體細(xì)胞核移植的研究.pdf

1、體細(xì)胞克隆豬在人的動(dòng)物疾病模型和人類異種器官移植方面具有巨大的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力,已成為當(dāng)今體細(xì)胞克隆領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究以莆田黑豬耳成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞,豬卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞,以建立高效的豬體細(xì)胞核移植體系為目的,主要優(yōu)化了卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)條件,研究了成熟卵母細(xì)胞的孤雌激活方法,以及微電極融合法對重構(gòu)胚融合率的影響,應(yīng)用開放式拉長細(xì)管(OPS)對重構(gòu)胚胎進(jìn)行了玻璃化冷凍,結(jié)果表明:
　　 1、本試驗(yàn)采用出生3～5d的莆田黑

2、豬,采用組織塊法培養(yǎng)豬耳成纖維細(xì)胞,傳代、純化及冷凍后,得到了大量穩(wěn)定的供體細(xì)胞系。
　　 2、對影響卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(IVM)的幾項(xiàng)因素即卵母細(xì)胞的培養(yǎng)方式,石蠟油的添加,不同外源激素的組合及ITS的添加進(jìn)行研究分析,結(jié)果顯示(1)凹槽皿組豬卵母細(xì)胞成熟率高于四孔板和30mm塑料皿,但差異不顯著(P＞0.05)。(2)石蠟油的添加對卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵母細(xì)胞體外成熟率均有顯著提高(P＜0.05)。(3)激素PMSG+HCG+F

3、SH組高于FSH+LH和HMG組(80.1％vs68.3％vs53.3％),相互之間差異顯著(P＜0.05)。(4)在豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加1％ITS(v/v),結(jié)果,卵母細(xì)胞成熟率沒有明顯提高,但顯著提高了孤雌激活后胚胎的卵裂率和囊胚率(63.3％vs55.1％,18.7％vs12.1％)(P＜0.05),說明在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加1％ITS能夠顯著提高豬卵母細(xì)胞激活后孤雌胚胎發(fā)育力。
　　 3、為優(yōu)化并提高卵母細(xì)胞的

4、孤雌激活效率,研究了不同濃度離子霉素作用不同時(shí)間并聯(lián)合6-DMAP對豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響。結(jié)果表明5μM的離子霉素作用4min的卵裂/囊胚率最高(66.7％,13.6％),比較了不同電激活參數(shù)對孤雌胚發(fā)育的影響,經(jīng)多次孤雌激活試驗(yàn)表明激活參數(shù)120v/mm,60μs,1DC的激活效果最佳。探討了不同培養(yǎng)基對孤雌胚體外發(fā)育的影響,結(jié)果表明NCSU-23和PZM-3培養(yǎng)孤雌胚胎卵裂率無明顯差異(55.2％,56.1％),但在囊胚率上,P

5、ZM-3顯著高于NCSU-23(13.8％vs7.84％,P＜0.05)。
　　 4、為了提高重構(gòu)胚的融合效率,試驗(yàn)采用微電極融合法,與傳統(tǒng)的槽式融合法相比,顯著提高了重構(gòu)胚的融合效率(84.8％vs64.4％,P＜0.05),卵裂率和囊胚率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。多次融合激活試驗(yàn)摸索了微電極融合激活的最佳參數(shù)為16v,20μs,1DC。
　　 5、采用開放式拉長麥管(OPS)玻璃化冷凍克隆胚的桑葚胚和囊胚,結(jié)果: