廣西巴馬小型豬體細胞核移植體系的建立.pdf

1、本研究對廣西巴馬小型豬體細胞核移植體系的建立進行了初步探討。本論文主要包括兩大部分，第一部分是文獻綜述，第二部分是試驗研究。試驗研究包括：（一）廣西巴馬小型豬體細胞培養(yǎng)體系的建立；（二）豬卵母細胞孤雌激活體系的建立；（三）廣西巴馬小型豬體細胞核移植體系的建立。試驗研究的方法和結(jié)果歸納如下：
　　 1．本試驗旨在建立廣西巴馬小型豬附睪成纖維細胞體外培養(yǎng)體系，為體細胞克隆和轉(zhuǎn)基因等相關(guān)操作開辟新的供體細胞來源。利用微量液體組織塊貼壁

2、法原代培養(yǎng)分離附睪成纖維細胞，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)、冷凍和復(fù)蘇；通過接觸抑制和解除抑制研究該類細胞的增殖潛力；通過免疫熒光對其進行鑒定；通過脂質(zhì)體介導(dǎo)對分離到的附睪成纖維細胞進行EGFP-N1基因轉(zhuǎn)染。結(jié)果成功分離得到廣西巴馬小型豬附睪成纖維細胞，可以大量傳代和冷凍，目前已經(jīng)傳至60代以上，生長良好；冷凍復(fù)蘇和接觸抑制解除后仍可以正常培養(yǎng)和傳代；細胞免疫熒光檢測，波形蛋白表達陽性，角形蛋白表達陰性；轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光

3、，表明瞬時轉(zhuǎn)染附睪成纖維細胞可以獲得成功。結(jié)論：本實驗室可以成功分離廣西巴馬小型豬附睪成纖維細胞，在體外能穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代。既經(jīng)濟實用又簡單穩(wěn)定。
　　 2．本試驗旨在建立新生廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞體外培養(yǎng)體系，并探討其作為體細胞核移植供體和轉(zhuǎn)基因相關(guān)操作供體的可能性，為其提供豐富的供體細胞材料。方法：利用微量液體組織塊貼壁法原代培養(yǎng)分離腎成纖維細胞，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)、冷凍和復(fù)蘇；通過接觸抑制和解除抑制研究該類細胞的增殖潛力；

4、通過免疫熒光對其進行鑒定；通過脂質(zhì)體介導(dǎo)對分離到的廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞分別進行EGFP-N1和DsRed-N1基因轉(zhuǎn)染。結(jié)果成功分離得到廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞，體外可以大量傳代和冷凍，目前已經(jīng)傳至50代以上，生長良好；冷凍復(fù)蘇和接觸抑制解除后仍可以正常培養(yǎng)和傳代；細胞免疫熒光檢測，波形蛋白表達陽性，角形蛋白表達陰性；轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光和紅色熒光，表明瞬時轉(zhuǎn)染廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞可以獲得成功，其中轉(zhuǎn)

5、染DsRed-N1基因的廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞已經(jīng)傳代至60代以上。結(jié)論：本實驗室可以成功分離廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞，在體外能穩(wěn)定培養(yǎng)和傳代，并可以成功獲得轉(zhuǎn)基因的廣西巴馬小型豬腎成纖維細胞。
　　 3．本試驗旨在建立廣西巴馬小型豬腹部成纖維細胞、耳成纖維細胞、睪丸成纖維細胞、肺部成纖維細胞、脾成纖維細胞以及顆粒細胞體外培養(yǎng)體系，并探討其作為體細胞核移植供體和轉(zhuǎn)基因相關(guān)操作供體的可能性，為其提供大量豐富的供體細胞來源。使

6、用微量液體組織塊貼壁法原代培養(yǎng)分離以上幾種成纖維細胞，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)、冷凍和復(fù)蘇；根據(jù)細胞的形態(tài)、生長特性等觀察其體外的生長能力和增殖壽命；通過免疫熒光對分離到的新生廣西巴馬小型豬腹部成纖維細胞進行免疫熒光鑒定。結(jié)果成功分離得到了以上幾種成纖維細胞，體外可以傳代和冷凍；冷凍復(fù)蘇后仍可以正常培養(yǎng)和傳代；腹部成纖維細胞免疫熒光檢測，波形蛋白表達陽性，角形蛋白表達陰性。結(jié)論：本實驗室可以成功分離廣西巴馬小型豬腹部成纖維細胞、耳成纖維細胞、睪

7、丸成纖維細胞、肺部成纖維細胞、脾成纖維細胞以及顆粒細胞，在體外可以培養(yǎng)和傳代，可以為顯微操作核移植、手工核移植和轉(zhuǎn)基因相關(guān)操作等提供不同類型的供體材料。
　　 4．本試驗旨在建立豬卵母細胞孤雌激活體系，為體細胞核移植和轉(zhuǎn)基因核移植等提供條件。結(jié)果表明：卵母細胞用Ion處理1min，其分裂率顯著高于處理4min組(91.05％vs.77.56％，P＞0.05)，囊胚率也高于4min組，但差異不顯著(P＞o．05)。KEFACE-9

8、00融合儀下，當脈沖時程和脈沖次數(shù)固定時，卵母細胞的囊胚發(fā)育率會隨著場強的升高而增加，達到一定限度后又降低，2.0kv/cm組的囊胚率顯著高于2.2kv/cm(32.58％vs.20.91％，P＞0.05)；當場強和脈沖次數(shù)固定時，卵母細胞的囊胚發(fā)育率也會隨著脈沖時程的升高而降低，但差異不顯著(P＞0.05)。BTXECM2001融合儀下，當脈沖時程和脈沖次數(shù)固定時，卵母細胞的囊胚發(fā)育率會隨著場強的升高而增加，達到一定限度后又降低，但各

9、組間無差異(P＞0.05)；當場強和脈沖次數(shù)固定時，卵母細胞的囊胚發(fā)育率會隨著脈沖時程的升高而降低，10μs組顯著高于90μs組(33.77％vs．22.31％，P＞0.05)，卵母細胞的分裂率會隨著脈沖時程的升高而降低，10μs組顯著高于90μs組(93.51％vs．83.08％，P＞0.05)。6-DMAP對卵母細胞繼續(xù)激活培養(yǎng)時，其胚胎的分裂率顯著高于其它任何組(P＜0.05)，囊胚率顯著高于CB+CHX組(P＜o．05)，但與C

10、B和CHX組差異不顯著(P＞0.05)。胚胎培養(yǎng)液添加5％FBS組的囊胚率顯著高于其它任何組(48.3％vs.35.3％，9.4％，35.8％，P＞0.05)。胚胎培養(yǎng)液對照組囊胚率顯著高于添加pFF組(33.5％vs.18.1％，9.4％，7.6％，P＞0.05)。PZM-3+NCSU-23組孤雌胚胎的分裂率顯著高于對照組(98.0％vs.90.5％，P＞0.05)，囊胚發(fā)育率顯著高于對照組和PZM-3組(44.4％vs.32.7％，

11、40.5％，P＞0.05)，PZM-3組的囊胚率也顯著高于對照組(P＞0.05)，但分裂率差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)論：本試驗建立了高效的豬卵母細胞孤雌激活體系，為后續(xù)核移植相關(guān)工作的開展奠定了基礎(chǔ)和條件。
　　 5．本試驗旨在建立廣西巴馬小型豬體細胞核移植體系，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因克隆豬生產(chǎn)及其相關(guān)研究提供優(yōu)化條件。探討了盲吸法對豬卵母細胞的去核效率；利用分離到的廣西巴馬小型豬附睪成纖維細胞作供體構(gòu)建重構(gòu)胚胎，探討6-DMAP和C

12、B對其后續(xù)胚胎發(fā)育的影響；利用分離到的廣西巴馬小型豬腹部成纖維作供體，探討其對核移植胚胎的發(fā)育效率。結(jié)果表明：豬卵母細胞盲吸法去核的效率為73.75％;附睪成纖維細胞作供體構(gòu)建重構(gòu)胚胎，6-DMAP和CB對其后續(xù)胚胎發(fā)育沒有顯著差異（分裂率和囊胚率分別為：89.89％and6.74％vs.82.95％and5.68％，P＞0.05）；廣西巴馬小型豬腹部成纖維細胞作供體，重構(gòu)胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分別為55.40％，67.53％和6