抗FMDV核酶的篩選及其重組成纖維細胞株的建立.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一種世界性分布的傳染病,具有傳播速度快、感染力強、偶蹄類動物易感等特性?？谔阋卟《?Foot-and-mouth disease virus,FMDV)具有7個血清型和80個以上的亞型,該病毒各型之間無交叉免疫力,且非常容易發(fā)生變異。這些特點使得該病在世界范圍內不斷暴發(fā)流行,給畜牧業(yè)造成了巨大的損失。目前,世界各國除了研制開發(fā)FMD新型疫苗外,還積極探索其他有效的預防策略,

2、如利用轉基因技術提高動物自身對FMD的抵抗能力,以達到防止該病流行的目的。核酶是一類具有催化活性的小RNA,它可以特異性的結合并切斷病毒RNA,使病毒失活。此外,核酶不影響宿主細胞mRNA的正常活性,所以它是一種高效的、安全的新型酶。錘頭狀核酶是核酶家族眾多成員中的一員,較其它核酶具有分子量小、結構簡單、作用位點特異等優(yōu)點,目前已被許多國內外學者運用到疾病基因治療的研究中,為抗FMDV的研究提供了一個新的思路。我們可以通過轉基因技術使動

3、物自身表達抗FMDV的核酶,使病毒在動物體內不能復制及表達,以達到抗FMD的目的。
　　 在對O型FMDV CHA／99毒株2B、3D基因的RNA二級結構進行預測的前提下,根據(jù)錘頭狀核酶的設計原則,針對2B及3D基因片段尋找到6個錘頭狀核酶的催化作用位點,設計并合成出特異性的錘頭狀核酶；構建pEGFP-N1-2B、pEGFP-N1-3D重組表達質粒,分別與對應的錘頭狀核酶共轉染BHK-21細胞,通過熒光顯微鏡觀察及流式細胞檢測的

4、方法篩選出有效的核酶,在細胞水平上檢測其對FMDV的抑制效果。將篩選出的核酶基因構建重組表達質粒pGPU6／GFP／Neo-D42,轉染山羊成纖維細胞,通過G418篩選獲得單克隆細胞株,經擴大培養(yǎng)后用RT-PCR的方法進行驗證。
　　 熒光顯微鏡下觀察共轉染的BHK-21細胞,發(fā)現(xiàn)核酶D42能使熒光減弱,抑制了pEGFP-N1-3D的表達；流式細胞檢測結果進一步驗證了核酶D42的催化效率,可高達71％；通過對細胞病變程度的觀察發(fā)

5、現(xiàn),在相同時間內,轉染了核酶D42的實驗組病變細胞數(shù)目少于未轉染核酶D42的陽性對照組,說明在細胞水平上D42對FMDV也有明顯的抑制效果；將pGPU6／GFP／Neo-D42重組表達質粒轉染入山羊成纖維細胞,用800μg／mL濃度的G418進行細胞篩選,12天后得到一株表達D42核酶的單克隆細胞株,挑取單克隆細胞并傳代培養(yǎng),RT-PCR結果表明D42核酶已成功整合到該單克隆細胞株中。
　　 本論文運用核酶催化原理抑制FMDV的