轉(zhuǎn)人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞株的建立及轉(zhuǎn)基因奶山羊的鑒定.pdf

1、α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin，α-LA）是乳清蛋白中主要的鈣結(jié)合蛋白，同時還是乳糖合成酶的一個亞基，控制著乳糖的合成。α-LA能提高機體免疫力，有較高的營養(yǎng)價值，在人乳中含量約為2.9mg/mL，但在羊乳中含量較低，因此通過轉(zhuǎn)基因的方法提高羊乳中α-LA的水平，可提高羊乳的價值。本研究應(yīng)用基因克隆、細(xì)胞培養(yǎng)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、PCR和Western-blot等技術(shù)建立了轉(zhuǎn)α-LA基因的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞株（Goat fe

2、tal fibroblast cells，gFFCs），為制備轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊提供了供核細(xì)胞;同時應(yīng)用TAIL-PCR、RT-PCR和Western-blot技術(shù)對本實驗室制備的轉(zhuǎn)人α-LA基因奶山羊進行了鑒定。
　　(1)含調(diào)控序列的人α-LA全基因克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建。
　　以人基因組為模板，擴增含5'調(diào)控區(qū)和部分3'調(diào)控區(qū)的人α-LA全基因序列，將其克隆到pMD19-T載體上，構(gòu)建克隆載體PLAT;酶切質(zhì)粒B9獲得載體

3、片段NI3A（含Neo-IRES-EGFP共表達(dá)序列作為篩選標(biāo)記基因，1.7kb3'βLG作為3'調(diào)控序列），酶切PLAT獲得PLA，將二者連接得到乳腺特異性表達(dá)載體PLAN，經(jīng)酶切及測序鑒定均正確。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PLAN瞬時轉(zhuǎn)染至奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)。
　　(2)真核表達(dá)載體PLAN在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)及人α-LA檢測。
　　采用脂質(zhì)體Lipofectamin TM LTX Rea

4、gent+PLUSTM Reagent介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，以本實驗室保存的轉(zhuǎn)基因載體5A和NI3A為對照，將表達(dá)載體PLAN轉(zhuǎn)染進山羊乳腺上皮細(xì)胞。經(jīng)含胰島素（10μg/mL）、催乳素(5μg/mL)及氫化可的松（10μg/mL）的DMED/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)染24h、48h和72h收集上清液，Western blot檢測其α-LA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)液中有目的蛋白表達(dá)，分子量約為14kD，表明本實驗所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體能夠在

5、山羊乳腺細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)α-LA，為后續(xù)乳腺生物反應(yīng)器的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(3)整合含調(diào)控序列人α-LA基因奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞株的篩選。
　　采用脂質(zhì)體Lipofectamin TM LTX Reagent+PLUSTM Reagent介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將線性化的PLAN轉(zhuǎn)進奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中。用1000μg/mL G418抗性篩選1周，500μg/mL G418篩選2周，結(jié)合EGFP挑選出綠色熒光克隆擴大培養(yǎng);經(jīng)巢式PCR

6、擴增鑒定，篩選得到的細(xì)胞株均已成功整合目的基因。結(jié)果表明，本實驗得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株可以為制作轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊提供供核細(xì)胞。
　　(4)轉(zhuǎn)人α-LA基因奶山羊的鑒定。
　　用TAIL-PCR的方法獲得轉(zhuǎn)基因插入序列5'端和3'端已知序列鄰近的未知序列;用RT-PCR和Western-blot檢測乳腺上皮細(xì)胞中mRNA和羊乳中α-LA的表達(dá)情況。切膠回收TAIL-PCR產(chǎn)物，將測序結(jié)果與已知序列和奶山羊基因組序列比對，結(jié)果顯示外