不同冷凍程序和冷凍保護(hù)劑對(duì)延邊奶山羊耳部成纖維細(xì)胞冷凍效果的影響.pdf

1、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)是哺乳動(dòng)物胚胎工程的主要組成部分，是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物克隆的有效方法[1][2]。在畜牧產(chǎn)業(yè)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)中有著極其廣闊的應(yīng)用前景。然而動(dòng)物體細(xì)胞的體外培養(yǎng)是動(dòng)物克隆中非常重要的一環(huán)，但是由于哺乳動(dòng)物體細(xì)胞從動(dòng)物體分離后，在體外的生存期正常不會(huì)超過(guò)一年,而且還可能因?yàn)轭l繁傳代導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的變異,因此在常規(guī)體外培養(yǎng)條件下的細(xì)胞很難無(wú)限期保持原質(zhì)量。如果采取適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢Ⅲw外培養(yǎng)的細(xì)胞在超低溫條件下保存,即可使細(xì)胞的生命力固定

2、在某一階段而不衰老死亡,對(duì)動(dòng)物克隆研究具有非常重要的價(jià)值。
　　本實(shí)驗(yàn)以延邊奶山羊耳部成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，采用組織塊加酶消化培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞成功擴(kuò)增培養(yǎng)到5-6代后，用于冷凍保存實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)確定延邊奶山羊耳部成纖維細(xì)胞的最佳冷凍保存程序以及冷凍保護(hù)劑，來(lái)建立一套適合延邊奶山羊的冷凍體系，從而對(duì)這一優(yōu)良地方奶山羊品種進(jìn)行必要的保存，為以后應(yīng)用體細(xì)胞核移植方法重新擴(kuò)繁該品系提供重要材料。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如下：

3、　　1、選擇4種不同的冷凍保護(hù)程序（①4℃放30分鐘、-20℃2小時(shí)、液氮口10分鐘后投入液氮②4℃放30分鐘、液氮口2小時(shí)后投入液氮③液氮口放20分鐘后投入液氮④直接投入液氮），結(jié)果表明方法2和方法3差異不顯著，方法2解凍后細(xì)胞復(fù)蘇效果最好，細(xì)胞活率及培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞貼壁率均優(yōu)于其他方法。
　　2、選取5％、7.5%、10%和12.5%四個(gè)濃度的DMSO（二甲基亞砜）對(duì)延邊奶山羊耳部成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，結(jié)果顯示7.5%組冷

4、凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活率達(dá)到67.3%，培養(yǎng)24小時(shí)后貼壁率可達(dá)到65.9%，結(jié)果均高于其他各組。
　　3、選取5%、10%、15%和20%四個(gè)濃度的GC（甘油）對(duì)延邊奶山羊耳部成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，結(jié)果顯示15%組冷凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活率達(dá)到63.8%，培養(yǎng)24小時(shí)后貼壁率可達(dá)到63.3%，結(jié)果均高于其他各組。
　　4、選取5%、10%、15%和20%四個(gè)濃度的EG（乙二醇），對(duì)延邊奶山羊耳部成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。結(jié)果表明，15