不同冷凍保護(hù)劑在羊卵巢整體凍存中的效果比較.pdf

1、目的：
　　隨著診斷及治療手段的進(jìn)步，生育期女性癌癥患者的生存率顯著提升，但是，這些治療手段（如放化療）可能造成卵巢功能下降甚至衰竭。卵巢皮質(zhì)組織深低溫凍存現(xiàn)已作為放化療前保存生育力的方法應(yīng)用于臨床，但受限于移植后組織缺血損傷以及大量卵泡損失，而完整卵巢移植通過吻合血管可恢復(fù)血供，理論上能夠克服這個(gè)難題。完整卵巢冷凍與皮質(zhì)冷凍相似，常采用二甲基亞砜(DMSO)、甘油、動(dòng)物血清等冷凍保護(hù)劑，但某些冷凍保護(hù)劑對組織有一定毒性，且完整卵

2、巢冷凍保護(hù)劑的滲透及去除較皮質(zhì)塊更困難。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用自制梯度濃度混合程控降溫器官灌注儀，灌注不同冷凍保護(hù)劑，并進(jìn)行行程序化冷凍，探討其凍融羊完整卵巢的冷凍效果并篩選最佳冷凍保護(hù)劑組合。
　　方法：
　　28只羊卵巢均來自6至8個(gè)月、體重約30 kg的未孕母羊，隨機(jī)分配到新鮮對照組（A組）;海藻糖組（B組）;甘油保護(hù)劑組（C組）;DMSO組（D組），每組7只卵巢。對B、C、D組卵巢，通過卵巢動(dòng)脈插管并行絲線結(jié)扎固定，與梯度濃度混

3、合程控降溫器官灌注儀相連，向各組卵巢灌注相應(yīng)的冷凍保護(hù)劑。然后行程序化冷凍并投入液氮保存。將A組及復(fù)蘇后的B、C、D組卵巢通過分為兩半，其中1/2用4％多聚甲醛固定并制作切片、染色，行組織學(xué)分析及原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測，另1/2提取組織mRNA并通過RT-PCR技術(shù)檢測組織Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，BAX)及冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(Cold Inducible RNA-b

4、inding Protein，CIRP)的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.新鮮對照組的正常形態(tài)卵泡比率（93.46±2.30％）顯著高于甘油組（88.03±4.80％）及DMSO組（80.85±2.28％），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。海藻糖組（90.29±2.30％）正常卵泡形態(tài)比率與新鮮對照組無顯著性差異（P=0.07）。
　　2.新鮮對照組（1114.68±184.24個(gè)/400×視野）基質(zhì)細(xì)胞密度高于

5、B、C、D三組凍存組，其與DMSO組（906.14±304.78個(gè)/400×視野）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。海藻糖組（1020.83±278.39個(gè)/400×視野）及甘油組（1089.38±573.13個(gè)/400×視野）基質(zhì)細(xì)胞密度與新鮮組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.新鮮對照組TUNEL反應(yīng)陽性的細(xì)胞數(shù)目（13.86±13.22個(gè)/400×視野）凋亡數(shù)目明顯少于三組冷凍組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

6、)，凍存組中，海藻糖組（73.14±32.01個(gè)/400×視野）凋亡細(xì)胞數(shù)少于甘油組（166.43±60.88個(gè)/400×視野）及DMSO（250.29±85.90個(gè)/400×視野）組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.新鮮對照組及海藻糖組BAX mRNA相對GAPDH的表達(dá)量分別為0.016±0.019和0.026±0.024，明顯低于甘油組及DMSO組的相對表達(dá)量0.081±0.075、0.099±0.125，差異

7、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);三組凍存組的CIRP基因mRNA相對GAPDH的表達(dá)量均高于新鮮對照組（0.164±0.121），具有顯著性差異(P＜0.05)，且海藻糖組CIRP基因的mRNA相對表達(dá)量(0.512±0.226)明顯高于甘油組（0.252±0.129）及DMSO組（0.224±0.093），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.羊完整卵巢冷凍復(fù)蘇后卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，基質(zhì)細(xì)胞密度可較好維持