重組人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因奶山羊的制備及表達(dá)產(chǎn)物提取和抗菌活性研究.pdf

1、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，因其生物活性功能廣泛，已被應(yīng)用于醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、食品加工、保健品生產(chǎn)等領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上銷(xiāo)售的乳鐵蛋白及其相關(guān)產(chǎn)品主要從牛乳中分離純化所得。因其來(lái)源的限制，天然乳鐵蛋白的產(chǎn)量已經(jīng)無(wú)法滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白(Recombinent HumanLactoferrin，rhLF)作為天然乳鐵蛋白的替代品，已經(jīng)成為研究和開(kāi)發(fā)乳鐵蛋白的主要途徑。

2、
　　本研究中，使用本實(shí)驗(yàn)室保存的乳腺特異性表達(dá)重組人乳鐵蛋白載體菌株，通過(guò)擴(kuò)增后獲得乳腺特異性表達(dá)載體(PCL25/hLF)，雙酶切并切膠回收目的基因片段（zpz-1）;利用細(xì)胞顯微注射技術(shù)，將zpz-1注射入雌性奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞(N31);通過(guò)G418篩選，獲得16株胎兒成纖維細(xì)胞單克隆細(xì)胞株。經(jīng)PCR檢測(cè)，其中7株整合PCL25/hLF基因。以其中1株(N31zpz-1-13)作為供核細(xì)胞，使用核移植、電融合等技術(shù)獲得重

3、構(gòu)胚140枚，移植136枚，共移植9只受體，其中2只受體于移植后第22周分娩，獲得2只雌性奶山羊，分別編號(hào)為zp-71和zp-72，只有zp-71健康成長(zhǎng)至體成熟。經(jīng)PCR檢測(cè)，zp-71整合PCL25/hLF基因。待zp-71體成熟后發(fā)情時(shí)進(jìn)行人工配種，于配種后第22周分娩，連續(xù)收集30天羊乳。ELISA檢測(cè)zp-71羊乳清中rhLF的表達(dá)水平;使用AKATA蛋白純化系統(tǒng)，運(yùn)用陽(yáng)離子交換層析技術(shù)分離純化rhLF;以青鏈霉素、人初乳濃縮

4、乳清為陽(yáng)性對(duì)照，以正常羊乳濃縮乳清為陰性對(duì)照，以純化的rhLF(1mg)、轉(zhuǎn)基因奶山羊zp-71的濃縮乳清為實(shí)驗(yàn)組，制備藥敏紙片，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。
　　ELISA檢測(cè)zp-71乳清中rhLF的結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因奶山羊zp-71分娩后連續(xù)30天的乳清中均含有rhLF。對(duì)比天然乳鐵蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，本驗(yàn)室保存的PCL25/hLF表達(dá)載體（含β-casin與CMV復(fù)合啟動(dòng)子）能在轉(zhuǎn)基因羊乳腺中有效穩(wěn)定地表達(dá)。離子交換層析的結(jié)果顯示:以0.5M

5、 NaCl-HAC-Tris作為洗脫液進(jìn)行洗脫，得到兩個(gè)洗脫峰。SDS-PAGE電泳結(jié)果及凝膠成像結(jié)果顯示:洗脫峰Ⅰ中含有多條帶，洗脫峰Ⅱ?yàn)閱我粭l帶;Western Blotting結(jié)果顯示:洗脫峰Ⅱ中的產(chǎn)物為rhLF。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因奶山羊zp-71的乳清及其純化產(chǎn)物均具有抑菌活性，4h的抑菌圈分別為1.70cm和1.30cm。
　　本研究表明:應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的PCL25/hLF乳腺特異性表達(dá)載體制備的轉(zhuǎn)基因山羊具有

6、乳腺特異表達(dá)rhLF功能;并且，重組人乳鐵蛋白表達(dá)產(chǎn)物可以從轉(zhuǎn)基因羊乳汁中提取;提取獲得的rhLF和濃縮的轉(zhuǎn)基因乳清抑菌試驗(yàn)顯示均有抑菌活性。由此證明:人乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)基因山羊乳腺中表達(dá)的重組人乳鐵蛋白在乳汁中單獨(dú)存在，而且具有與天然人乳鐵蛋白相似的抗菌活性。研究也表明:運(yùn)用以HAC-Tris-NaCl為緩沖體系進(jìn)行洗脫的陽(yáng)離子交換層析技術(shù)可有效提取轉(zhuǎn)基因羊乳中的rhLF，這一結(jié)果在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)此方法的建立也為轉(zhuǎn)基因奶山羊乳中