15308.轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體綿羊成纖維細(xì)胞株的篩選

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號(hào)：S13165學(xué)位論文轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體綿羊成纖維細(xì)胞株的篩選指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：王子竹安鐵洙教授碩士2013年4月東北林業(yè)大學(xué)東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)論文答辯日期：2013年6月授予學(xué)位日期：2013年6月答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：聾夕厶櫛案大學(xué)摘要蜘蛛絲是目前己知的一種集多種優(yōu)良性能于一身的纖維，無(wú)論與其它天然材料還是人工合成的材料相比，蜘蛛絲都顯示出了絕對(duì)

2、的優(yōu)勢(shì)。但是由于蜘蛛的生活習(xí)性以及織網(wǎng)特點(diǎn)，無(wú)法通過(guò)人工進(jìn)行大規(guī)模飼養(yǎng)繁殖，這些都給蜘蛛絲的大量獲取造成了巨大困難。本研究通過(guò)綿羊可以產(chǎn)生由角蛋白構(gòu)成的羊毛為啟迪，利用本實(shí)驗(yàn)室前期合成的蜘蛛絲蛋白基因二聚體和綿羊毛發(fā)角蛋白啟動(dòng)子B2C，將B2C與報(bào)告基因相連，驗(yàn)證其是否具有表達(dá)活性，并將綿羊毛發(fā)角蛋白啟動(dòng)子與pcDNA3。1相連構(gòu)建真核表達(dá)載體，再與蜘蛛絲蛋白基因二聚體相連后轉(zhuǎn)染綿羊皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)擬蜘蛛絲蛋

3、白基因二聚體綿羊皮膚成纖維細(xì)胞系。為后續(xù)產(chǎn)生被毛中表達(dá)蜘蛛拖絲蛋白的轉(zhuǎn)基因綿羊奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與結(jié)論如下：(1)綿羊毛發(fā)角蛋白啟動(dòng)子B2C的活性檢測(cè)：將綿羊毛發(fā)角蛋白啟動(dòng)子pEasyT3一B2C與報(bào)告基因GFP相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒B2C—GFP，將其轉(zhuǎn)染綿羊皮膚成纖維細(xì)胞。結(jié)果在藍(lán)光激發(fā)下觀察到了綠色熒光，證明了該啟動(dòng)子在綿羊皮膚成纖維細(xì)胞中具有表達(dá)活性；(2)真核表達(dá)載體的構(gòu)建：將去除自身CMV巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的pcDNA31與

4、經(jīng)過(guò)相同酶切的啟動(dòng)子B2C相連接，再與蜘蛛拖絲蛋白基因二聚體2s相連接，成功構(gòu)建了真和表達(dá)載體pcDNA31一B2C一2S；(3)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞的篩選：通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將線性化的pcDNA31一B2C一2S轉(zhuǎn)染綿羊皮膚成纖維細(xì)胞，用最適終濃度的G418對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到了生長(zhǎng)狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；(4)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的檢測(cè)：提取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基因組DNA，通過(guò)PCR檢測(cè)顯示pcDNA31一B2C一2S整合到了綿羊皮膚成纖維細(xì)胞的基因