游離SiO2粉塵致肺成纖維細胞激活前后差異蛋白質(zhì)篩選.pdf

1、矽肺是塵肺病中發(fā)病快、病情嚴重、預后較差的一種,也是我國目前患病人數(shù)最多、危害性最大的一種職業(yè)病。矽肺的發(fā)病機制目前仍不清楚,矽肺的基本病理變化是以形成矽結(jié)節(jié)為主和有一定間質(zhì)性纖維增生。在纖維化的發(fā)展過程中,肺成纖維細胞是一種重要的效應細胞。肺成纖維細胞被激活,轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞是纖維化過程中的一種重要改變。肺成纖維細胞激活前后,蛋白質(zhì)分泌及合成發(fā)生相應的改變,蛋白質(zhì)組學技術是進行蛋白質(zhì)表達研究的有力手段。
　　 目的
　

2、　 利用雙向凝膠電泳技術分離激活和未激活的肺成纖維細胞表達的差異蛋白質(zhì),并對差異蛋白質(zhì)進行鑒定,為探討矽肺生物標志提供相關依據(jù)和基礎資料。
　　 方法：
　　 1.實驗組和對照組分別使用經(jīng)SiO2刺激和未經(jīng)SiO2刺激的大鼠肺巨噬細胞上清液,刺激大鼠肺成纖維細胞,分別得到激活和未激活的肺成纖維細胞。
　　 2.應用固相IPG梯度膠條,進行雙向凝膠電泳,分離激活前后的肺成纖維細胞的血清總蛋白,凝膠經(jīng)銀染顯色后,用

3、Amersham掃描儀獲得凝膠圖像。經(jīng)ImageMaster2D Platinum6.0專用凝膠圖像分析軟件進行分析后,找出有差異的蛋白點。
　　 3.從凝膠上挖下部分差異表達的蛋白點,使用胰蛋白酶進行膠內(nèi)原位酶切,經(jīng)MALDI-TOF-MS儀分析獲得的肽質(zhì)量指紋圖,然后利用Mascot查詢軟件搜尋數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)獲得了較好的雙向電泳銀染圖譜。經(jīng)圖像分析檢測發(fā)現(xiàn)2塊膠斑點匹配率達75

4、％。
　　 (2)實驗組和對照組的雙向電泳圖譜經(jīng)ImageMaster2D Platinum6.0軟件匹配分析,共篩選出13個差異的蛋白點,其中編號為1-4的蛋白點只在激活的肺成纖維細胞中表達；編號為5-7的蛋白點只在未激活的肺成纖維細胞中表達；編號為8-11的蛋白點在激活的肺成纖維細胞中高表達；編號為12、13的蛋白點在未激活的肺成纖維細胞中高表達。
　　 (3)從13個差異蛋白點中選出7個蛋白點,經(jīng)膠內(nèi)原位酶切-質(zhì)譜

5、指紋圖譜分析,獲得了6張肽質(zhì)量指紋圖譜,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢分析,成功鑒定出6個蛋白質(zhì)分別為:不均一核糖核蛋白A2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotelnA2)、膠轉(zhuǎn)蛋白2(transgelin2)僅在激活后表達,3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde3-phosphate-dehydrogenase)、波形蛋白,CRA-b亞型(vimentin,isoform CPA-b)、過氧化還原酶5(