應用Label-free技術研究人牙囊細胞和牙周膜成纖維細胞蛋白質組.pdf

1、牙囊細胞（Human dental follicle cells，hDFCs）是形成以牙周膜為主體的牙周組織的前體細胞,牙周膜成纖維細胞（Human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs）是 hDFCs的重要子代細胞，參與牙周膜內膠原纖維等細胞外基質代謝。由于牙周炎較高的發(fā)病率及其造成的牙齒缺失，以建立牙周附著為中心的牙周組織再生一直被眾多學者關注。而牙周組織中，hDFCs和hPDLFs是具有組

2、織同源性和生物延續(xù)性、處于分化不同階段的細胞。hP DLF s繼承了hDFCs的很多特性，如形態(tài)上二者都具有成纖維細胞樣形態(tài)，生物學上都具有的異質性，功能上都具有纖維形成和改建能力。近年對hDFCs向 hPDLFs轉化的研究也集中在細胞分化及再生有附著性的牙周膜上，這些研究多關注個別基因、蛋白質、細胞因子、信號通路對hDFCs體內、體外成骨、成纖維能力的影響，也有使用高通量方法研究分化前后兩種細胞基因水平的差異，但是對hDFCs轉化為

3、hPDLFs后的總體細胞代謝、蛋白表達變化并不關注。而在后基因時代，蛋白質表達譜更能體現牙囊和牙周膜功能狀態(tài)的異同性。從蛋白水平探究細胞在分化前后的差別，有助于發(fā)現細胞分化前后哪些蛋白質發(fā)生了顯著改變，為研究hDFCs成纖維分化機制提供蛋白質水平參考。
　　本研究擬使用Label free蛋白定量技術研究hDFCs和hPDLFs蛋白表達譜及差異表達蛋白質，為尋找hDFCs向 hPDLFs轉化的重要蛋白質及臨床探索再生纖維性牙周附著

4、技術提供參考。
　　目的：
　　1.分離培養(yǎng)hDFCs和hPDLFs及蛋白質樣品準備
　　2.獲得hDFCs和hPDLFs細胞全蛋白表達譜，進行相似性分析
　　3.尋找hDFCs和hPDLFs差異蛋白質分析，差異蛋白質qPCR驗證及細胞代謝差異分析
　　材料和方法：
　　1.分離培養(yǎng)、鑒定hDFCs和hPDLFs，應用SDS-PAGE電泳對hDFCs和hPDLFs細胞總蛋白質進行蛋白豐度初步分析。

5、r>　　2.利用LTQ orbitrapVelos液質聯(lián)用儀配備戴安ultramate3000 nano-UPLC操作系統(tǒng)對預處理蛋白樣品 hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2中肽段行質譜分析，結合定性定量軟件maxquant(1.5.0.12)，參考IPI人蛋白質數據V3.87獲得hDFCs和hPDLFs的蛋白質原始數據。相同樣本進行生物學重復性、關聯(lián)性分析。對 hDFCs和hPDLFs總蛋白質行蛋白比例、蛋白相

6、對含量及基因本體（Gene ontology，GO）分析。
　　3.結合蛋白質鑒定原始數據，對hDFCs和hPDLFs蛋白譜行差異表達分析，并所得差異蛋白質行GO分析、KEGG分析及qPCR驗證。
　　結果：
　　1.免疫熒光顯示hDFCs和hPDLFs細胞角蛋白陰性表達，波形絲蛋白陽性表達，具有成纖維細胞的生物學特性。SDS-PAGE證明 hDFCs和hPDLFs細胞總蛋白質中均無極高豐度蛋白質。
　　2.液相

7、色譜質譜分析hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2四樣本共獲得906
　　個蛋白質組，相同樣本間具有較高的重復性和關聯(lián)性。蛋白比列分析、蛋白相對含量分析及GO分析均顯示hDFCs和hPDLFs蛋白質表達譜具有較高的相似性。
　　3. hDFCs和hPDLFs差異表達蛋白質有22個（P<0.5，FC>2），其中上調蛋白質7個（DRAP1、ECI1、EIF3G、HSP90B1、NIT1、PPP1CB、STX7

8、），下調蛋白質15個（AKR1A1、ALCAM、CDC42、C TGF、CYR61、DDX1、DDX17;DDX5、DDX39A、F2、FKBP4、FST、GDI1;GDI2、MAT2A、RPL18A、TOMM6）。對特定差異蛋白行qPCR驗證，顯示hDFCs和hPDLFs中FST、CTGF、STX7、NIT1的表達變化與質譜結果一致，但C TGF的組間差別無統(tǒng)計學意義。此外，GO分析顯示hDFCs向成纖維細胞分化后伴隨著細胞蛋白質合成

9、、分泌功能加強。
　　結論：
　　hDFCs和hP DLF s細胞形態(tài)學的相似性、生物學功能上的延續(xù)性集中表現在蛋白質表達譜的相似性上。但是由于兩種細胞處于牙周組織分化不同階段及分化前后細胞微環(huán)境的差異性持續(xù)存在，定量分析證實22個蛋白質有明顯的表達差異。本實驗獲得的差異蛋白質可能是 hDFCs較 hPDLFs具有更高增殖分化能力、hPDLFs較hDFCs具有更高膠原代謝能力的分子表現。這些差異蛋白質為進一步研究hDFCs向