結(jié)腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的鑒定及其在腫瘤發(fā)展中作用的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移受腫瘤微環(huán)境(Microenvironment)影響。在實(shí)體腫瘤組織中，除了腫瘤細(xì)胞本身外，腫瘤微環(huán)境中還包含胞外基質(zhì)、信號(hào)分子和基質(zhì)細(xì)胞，其中基質(zhì)細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。而成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的基質(zhì)細(xì)胞。
　　分泌蛋白質(zhì)組這一概念最早是由Tjalsma等在研究枯草桿菌分泌蛋白時(shí)首次提出。廣義上說，分泌蛋白質(zhì)組是指細(xì)胞、

2、組織或器官釋放到胞外的全部蛋白質(zhì)，既包括經(jīng)典途徑所分泌的蛋白，也包括非經(jīng)典途徑分泌的蛋白，還包括通過胞外體分泌的蛋白質(zhì)以及膜蛋白剪切釋放的蛋白。隨著腫瘤生物標(biāo)記物研究的進(jìn)展，分泌蛋白的研究逐漸成為熱點(diǎn)。分泌蛋白可能成為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物，也可能成為藥物治療的靶點(diǎn)。近年來，蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，極大促進(jìn)了分泌蛋白組學(xué)的研究和發(fā)展。
　　本課題組以我們分離的兩對(duì)成纖維細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞系為模型，利用多種共培養(yǎng)技術(shù)研究成纖維細(xì)胞對(duì)腫

3、瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)工具分析成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌蛋白組學(xué)，鑒定了一系列成纖維細(xì)胞特異表達(dá)的分泌蛋白。這些研究對(duì)結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境的研究提供了一定的基礎(chǔ)。論文分四部分進(jìn)行論述:
　　第一部分:前言。這一部分重點(diǎn)概述了腫瘤微環(huán)境的理論，腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)的影響，以及分泌蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的重要作用。說明了本論文的選題目的及意義。
　　第二部分:結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞分泌蛋白的非標(biāo)

4、記定量的鑒定及其在結(jié)腸癌發(fā)展中的作用。這部分分為三章。
　　第一章:利用多種共培養(yǎng)技術(shù)研究結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。我們分離了兩對(duì)結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞，包括正常成纖維細(xì)胞(Normalfibroblast，NF)及結(jié)腸癌腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer-associated fibroblast, CAF),并利用免疫蛋白印跡及免疫熒光技術(shù)對(duì)分離的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。接著我們應(yīng)用接觸式及非接觸式共培技術(shù)對(duì)成纖維細(xì)

5、胞與結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)，結(jié)果顯示無論是NFs還是CAFs都對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用。這個(gè)結(jié)果在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也得到證實(shí)。在此基礎(chǔ)上我們收集了成纖維細(xì)胞分泌的上清，并將上清濃縮或不濃縮與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，與細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果一致。
　　第二章:結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞分泌蛋白的非標(biāo)記定量的鑒定結(jié)果。根據(jù)第二部分第一章可知，結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞的分泌蛋白可能是結(jié)腸癌微環(huán)境中影響結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因子。我們運(yùn)用LC-M

6、S Synapt G1質(zhì)譜儀鑒定到227個(gè)非冗余蛋白，包括131個(gè)分泌蛋白和20個(gè)膜蛋白，肽段的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)為1.3％。為了解以上的分泌蛋白在總體上的分子特征，我們利用多種生物信息學(xué)工具對(duì)以上數(shù)據(jù)作了分析。GO分析發(fā)現(xiàn)這些分泌蛋白主要與胞外基質(zhì)、細(xì)胞粘著及運(yùn)動(dòng)、免疫應(yīng)答、氧化還原穩(wěn)態(tài)及蛋白水解酶抑制劑有關(guān)。
　　第三章:成纖維細(xì)胞分泌蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。根據(jù)組學(xué)結(jié)果及篩查條

7、件，我們用免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了8個(gè)候選蛋白，分別是富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein，acidic and rich in cyst-eine，SPARC)、人轉(zhuǎn)膠蛋白(Transgelin, TAGLN)、Collagen Alpha-1(Ⅲ)(COL3A1)、Decorin(DCN)、Pentraxin-related Protein3(PTX3)、Periostin(POSTN)、Insulin-like

8、GrowthFactor-binding Protein5(IGFBP5)和卵泡抑素樣蛋白1(Follistatin-Like1，F(xiàn)STL1)。其中，SPARC、TAGLN、COL3A1、IGFBP5和FSTL1僅在成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清中能被檢測(cè)。我們?cè)诔衫w維細(xì)胞系CCD18Co中干擾這4種基因的表達(dá)并用于共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組實(shí)驗(yàn)組中干擾TAGLN和FSTL1都顯著促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。而在CCD18Co中過表達(dá)FSTL1后將上

9、清與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)則表現(xiàn)了顯著抑制生長(zhǎng)的作用。這些結(jié)果表明FSTL1可能是一個(gè)成纖維細(xì)胞分泌的腫瘤抑制因子。
　　第三部分:結(jié)腸癌成纖維細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞差異表達(dá)分泌蛋白的標(biāo)記定量鑒定。利用標(biāo)記定量法iTRAQ技術(shù)對(duì)2對(duì)原代成纖維細(xì)胞、1個(gè)正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞系及3個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系總共8個(gè)細(xì)胞系的分泌蛋白進(jìn)行了標(biāo)記，利用QSTAR質(zhì)譜儀，在3次重復(fù)的質(zhì)譜分析中鑒定到了2，338個(gè)非冗余蛋白，其中有898個(gè)在3次重復(fù)分析中都獲得了定量信

10、息。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)組間t檢驗(yàn)方法，得到P＜0.05的顯著差異蛋白184個(gè)，其中相差2倍的蛋白有159個(gè)，相差5倍以上的蛋白有75個(gè)，肽段的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率為1％。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)軟件分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要為ECM蛋白，生物功能上主要與ECM受體相互作用、細(xì)胞粘著、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞癌癥通路有關(guān)。VIM也是成纖維細(xì)胞分泌蛋白中鑒定到的豐度最高的蛋白。其次我們還鑒定到了已知在腫瘤微環(huán)