人胃癌組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的分離及其轉(zhuǎn)錄組學(xué).pdf

1、目的：分離并鑒定胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（gastric cancer-associated fibroblasts，CAFs）、癌旁正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs）及原代胃癌細(xì)胞（primary gastric carcinoma cells），比較CAFs與NFs的增殖差異以及對原代胃癌細(xì)胞克隆形成的影響，初步探討CAFs與NFs轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。
　　方法:（1）選取臨床胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁

2、正常組織（距癌周5cm以上、病理檢測陰性），剪碎后膠原酶消化接種于預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞中平滑肌肌動蛋白α（α-smooth muscle actin,α-SMA）和纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）的表達(dá)鑒定CAFs與NFs，實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測細(xì)胞中α-SMA基因mRNA的表達(dá)水平；用HE染色、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及免疫細(xì)胞化

3、學(xué)檢測細(xì)胞中癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和角蛋白18（cytokeratin18，CK-18）的表達(dá)鑒定原代胃癌細(xì)胞。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測CAFs與NFs的增殖并繪制生長曲線；將原代胃癌細(xì)胞分別與CAFs和NFs混合培養(yǎng)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及結(jié)晶紫染色檢測原代胃癌細(xì)胞的克隆形成能力；幽門螺旋桿菌以感染復(fù)數(shù)1:100分別感染CAFs及原代胃癌細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)菌對細(xì)胞的黏附情況。（2）挑選3對臨床

4、表型相似、病理診斷為胃腺癌的病人的CAFs與NFs，配對進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，以CAFs/NFs比值差異兩倍以上的基因?yàn)橛幸饬x的差異表達(dá)基因，將3個生物學(xué)重要組的差異基因兩兩交集之后并集，利用omicsbean在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：（1）成功從胃癌組織中分離出8株CAFs，5株NFs，3株原代胃癌細(xì)胞，且均能良好傳代培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示α-SMA、FAP的表達(dá)在CAFs中成強(qiáng)陽性，在NFs中弱陽性或陰性，且兩者

5、均不表達(dá)CK-18；RT-qPCR結(jié)果顯示CAFs中α-SMA基因的mRNA表達(dá)量顯著高于NFs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示CAFs與NFs分離成功。生長曲線結(jié)果顯示培養(yǎng)3天后CAFs的生長速度顯著高于NFs，培養(yǎng)六天時差異達(dá)到最大（P<0.05）。（2）HE染色結(jié)果顯示3株原代胃癌細(xì)胞呈現(xiàn)多形性、核大、畸形、核質(zhì)比增大、核仁數(shù)增多，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示原代胃癌細(xì)胞中CEA、CK-18的表達(dá)均為強(qiáng)陽性，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6、顯示3株原代胃癌細(xì)胞均能在體外三維生長形成克隆球，提示分離的原代胃癌細(xì)胞具有惡性特征，鑒定成功。當(dāng)CAFs與原代胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，原代胃癌細(xì)胞的克隆數(shù)（70.4±8.6），顯著高于NFs組（35.2±5.7）與空白對照組（33.1±6.6）（P<0.05），而NFs組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此外，幽門螺旋桿菌不僅能夠黏附胃癌細(xì)胞，也能黏附CAFs。（3）轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示，在3個生物學(xué)重復(fù)組的CAFs中共獲得14

7、7個差異基因，其中76個基因上調(diào)，71個基因下調(diào)。通過聚類分析、GO富集與KEGG富集，共富集到1727個生物學(xué)過程、84個細(xì)胞組分、153個分子功能和10個通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：1.成功從臨床胃癌組織中分離到原代的CAFs、NFs和胃癌細(xì)胞。2.證實(shí)CAFs在體外的生長速度快于NFs，促進(jìn)胃癌細(xì)胞克隆性生長的能力更強(qiáng)。3.在CAFs中獲得147個差異表達(dá)的基因，參與腫瘤相關(guān)的重要生物學(xué)過程和信號通路，可能在胃癌的發(fā)生發(fā)