胃癌相關成纖維細胞條件培養(yǎng)基對胃癌細胞增殖和侵襲的影響及相關機制的初步探討.pdf

1、目的：探討胃癌相關成纖維細胞(GCAF)的條件培養(yǎng)基(CM)對胃癌細胞增殖和侵襲的影響及其相關機制。方法：將胃癌相關成纖維細胞的條件培養(yǎng)基(GCAF-CM)和人胃粘膜成纖維細胞條件培養(yǎng)基(HGMF-CM)分別加入胃癌細胞系BGC-823和MKN-45中培養(yǎng)，通過對BGC-823和MKN-45系胃癌細胞的增殖檢測、侵襲試驗和細胞周期檢測的研究，分析GCAF-CM對胃癌細胞生物學行為的影響；使用RayBio(R)人細胞因子抗體芯片，初步篩選

2、出胃癌相關成纖維細胞來源的與腫瘤相關的細胞因子。結果：與純RPMI1640培養(yǎng)液組及HGMF-CM組相比，GCAF-CM組胃癌細胞增殖活性在BGC-823和MKN-45兩種胃癌細胞系中均增高(P值均＜0.05)，且胃癌細胞的增殖能力與GCAF-CM的蛋白含量成正相關；GCAF-CM組(蛋白濃度分別為0.5ug/uL、1.0ug/uL)所觀察到的侵襲胃癌細胞數(shù)量均增多(P值分別=0.0335、0.0003)；GCAF-CM組增殖指數(shù)(P=

3、0.002)和S期細胞百分數(shù)(P=0.0199)均增高。與人胃粘膜成纖維細胞條件培養(yǎng)基(HGMF-CM)組相比，GCAF-CM組中細胞因子表達量存在差異的共31個，其中表達量上調的有19個，與腫瘤相關的細胞因子有15個，表達量下調的有12個，與腫瘤相關的細胞因子有4個。結論：GCAF-CM可增強胃癌細胞的增殖能力、侵襲能力及細胞周期活性，這可能與GCAF-CM中某些細胞因子表達量的上、下調有關。
　　 胃癌是一種常見的惡性腫瘤，

4、日本、巴西、哥倫比亞、中國、韓國等國家是胃癌高發(fā)區(qū)。胃癌在我國的病死率居各種癌癥之首位[1]，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率并不平衡，但病人總體5年死亡率超過80％，每年因胃癌死亡的人數(shù)居世界癌癥死亡病人的第二位[2]，嚴重威脅著人類健康。新近，腫瘤研究中出現(xiàn)了一些新的思路和技術，例如對腫瘤微環(huán)境的再認識以及蛋白質組學的迅猛發(fā)展，將為胃癌發(fā)病機理和防治研究帶來新的契機。腫瘤組織微環(huán)境由功能性上皮、細胞外基質(Extracellular matrix

5、，ECM)和間質細胞三部分組成，后者主要包括成纖維細胞、各種免疫細胞和血管/淋巴管內(nèi)皮細胞；此外，腫瘤細胞還可以合成、分泌到細胞外間隙中新的基質成分[3]。目前對腫瘤微環(huán)境的認識主要包括[3-7]：1.微環(huán)境是細胞基因不穩(wěn)定性的來源，可以誘發(fā)基因突變和DNA損傷，并導致DNA修復通路失調；2.許多有明確致癌作用的理化因素(慢性炎癥、化學致癌物等)是通過破壞微環(huán)境的組織結構、改變間質細胞因子表達譜并重塑細胞外基質，從而刺激功能細胞發(fā)生惡變

6、的；3.腫瘤細胞生長、侵襲、轉移所需的氧、營養(yǎng)成分和生長刺激信號被認為是來自于周圍的間質細胞；4.在適當?shù)奈h(huán)境中，惡性細胞可以被誘導恢復分化狀態(tài)。5.ECM中存在的抗腫瘤成分，例如：腫瘤抑素(tumstatin)、內(nèi)皮抑素(endostatin)，已經(jīng)得到成功分離正在進行臨床試驗。
　　 現(xiàn)有的一些研究已經(jīng)表明，成纖維細胞在腫瘤微環(huán)境中的研究有著重要意義和良好前景[8-11]：1.成纖維細胞組織微環(huán)境中主要的間質細胞，也是產(chǎn)生

7、ECM(例如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原與纖維連接蛋白)和組織蛋白酶的主要細胞，處于“基質母細胞”的地位；2.成纖維細胞是正常組織結構的“守護者”，存在抑制周圍上皮細胞發(fā)生惡變的機制，已發(fā)生癌變的細胞在正常成纖維細胞環(huán)境下也可以向正常細胞分化；3.成纖維細胞還是上皮細胞增生、分化的“調控者”，成纖維細胞發(fā)生轉化后可以表達多種細胞因子、粘附分子直接作用于上皮細胞，促進腫瘤細胞的發(fā)生、生長、血管生成、浸潤與轉移。因此，對腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞進行深入研

8、究必將有助于對腫瘤發(fā)生機制以及浸潤、轉移等生物學行為的理解以及新的治療靶點的發(fā)現(xiàn)。
　　 在項目之前的研究中，我們已經(jīng)在體外建立了胃癌間質成纖維細胞的模型，并對其生物學特性進行了初步研究。本課題著重在于收集胃癌相關成纖維細胞和人胃粘膜成纖維細胞的培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基，分別加入BGC-823和MKN-45系胃癌細胞并與之共培養(yǎng)，通過對胃癌細胞的增殖檢測、侵襲試驗和細胞周期檢測的研究，分析胃癌相關成纖維細胞條件培養(yǎng)基(GCAF-

9、CM)對胃癌細胞生物學行為的影響，為進一步對胃癌微環(huán)境中促進胃癌細胞生長與侵襲的因子的研究提供實驗依據(jù)。我們還使用RayBio(R)人細胞因子抗體芯片，初步篩選出了胃癌相關成纖維細胞來源的與腫瘤相關的細胞因子，為進一步篩選出胃癌相關成纖維細胞來源的與胃癌的發(fā)生、進展和轉移密切相關的細胞因子并深入探討其對胃癌的具體影響及作用機制，打下了一個良好的基礎。
　　 第一部分胃癌相關成纖維細胞條件培養(yǎng)基對胃癌細胞增殖和侵襲的影響
　

10、　 探討胃癌相關成纖維細胞的條件培養(yǎng)基對胃癌細胞增殖和侵襲的影響，為進一步對胃癌微環(huán)境中促進胃癌細胞生長與侵襲的因子的研究提供實驗依據(jù)。
　　 結論：
　　 1.GCAF-CM可增強胃癌細胞的增殖能力、侵襲能力，且胃癌細胞的增殖、侵襲能力與GCAF-CM的蛋白含量成正相關。
　　 2.GCAF-CM可增強胃癌細胞的細胞周期活性。
　　 第二部分胃癌相關成纖維細胞來源的細胞因子的初步篩選
　　 篩

11、選出胃癌相關成纖維細胞來源的與腫瘤相關的細胞因子，為進一步篩選出胃癌相關成纖維細胞來源的與胃癌的發(fā)生、進展和轉移密切相關的細胞因子并深入探討其對胃癌的具體影響及作用機制打好基礎。
　　 結論：篩選出的這些細胞因子中，很多細胞因子表達量的變化與腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲、轉移密切相關。其中表達上調的有：IL-1β、TNFα、TNFβ、IL-17、IL-6、M-CSF、MIF、MIP-1、HGF、SDF-1、IGFBP-1、IGFB