EphA2基因沉默對胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲力的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景：胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。盡管近年來外科技術(shù)的進(jìn)步和采用包括化療、放療在內(nèi)的多種治療手段，但世界范圍內(nèi)進(jìn)展期胃癌的5年生存率仍不超過25％。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)是胃癌患者主要的死亡原因，也是影響臨床治療和預(yù)后的關(guān)鍵因素，因此研究胃癌發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有十分重要的意義。受體酪氨酸激酶(RTKs)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用。人肝細(xì)胞生促紅素(Eph)基因家族是目前已知RTK中最大的亞族，

2、具有受體酪氨酸激酶的活性，能將外界刺激信息傳遞至細(xì)胞核并轉(zhuǎn)化成細(xì)胞效應(yīng)的信號通路的關(guān)鍵組成部分。其中EphA2受體是已發(fā)現(xiàn)的14種Eph受體中的一員，其基因位于被認(rèn)為是腫瘤“熱點(diǎn)”的染色體lp36.1。EphA2在許多腫瘤中呈高表達(dá)和高活性，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)。過表達(dá)的EphA2能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞向外侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，但是EphA2促進(jìn)腫瘤侵襲具體的作用機(jī)制目前仍不十分清楚。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中重要成員，屬于明膠

3、酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)主要成分。目前MMP-9被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶。研究表明通過檢測肝細(xì)胞癌和卵巢癌組織中EphA2與MMP-9的表達(dá)兩者存在正相關(guān)性，但是EphA2是否通過MMP-9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的發(fā)揮作用至今未見相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：探討EphA2在胃癌侵襲過程中的作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.采用免疫組織化學(xué)法檢測97例胃癌組織和24例正常胃粘膜組織中Eph

4、A2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表達(dá)情況，分析胃癌組織中EphA2和MMP-9的表達(dá)與臨床病理因素及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　 2.構(gòu)建特異性EphA2siRNA表達(dá)載體，并借助脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入胃癌SGC-7901細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（未轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞）、陰性對照組（陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞）和EphA2siRNA組（EphA2siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞）。用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtimeRT-PCR)

5、檢測EphA2mRNA表達(dá)變化，westernblot檢測EphA2蛋白表達(dá)變化，噻唑藍(lán)法(MTT)觀察細(xì)胞生長，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移和侵襲情況，并用realtimeRT-PCR和westernblot檢測MMP-9表達(dá)。
　　 3.建立裸鼠皮下胃癌SGC-7901細(xì)胞移植瘤模型后，18只裸鼠隨機(jī)分成三組：空白對照組（生理鹽水瘤內(nèi)注射）、陰性對照組（陰性對照質(zhì)粒＋脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射）和Eph

6、A2siRNA組（EphA2siRNA質(zhì)粒＋脂質(zhì)體瘤內(nèi)注射），以上處理隔天一次，共6次。每周定期測量不同處理組裸鼠皮下移植瘤體積，第一次治療后第21天處死裸鼠并測量瘤體重量，并用免疫組織化學(xué)法檢測移植瘤EphA2和MMP-9蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.與正常胃粘膜組織相比，胃癌組織中EphA2和MMP-9呈強(qiáng)表達(dá)(P＜0.01)；胃癌組織中EphA2和MMP-9蛋白強(qiáng)弱表達(dá)均與胃癌的大小、浸潤深度、腫瘤TNM分

7、期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目有關(guān)(P＜0.05)，并且MMP-9蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)(P＝0.029)；胃癌組織中EphA2和MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r＝0.732,P＜0.01)；單因素分析EphA2蛋白強(qiáng)表達(dá)組5年生存率明顯低于弱表達(dá)組(P＝0.037)，并且MMP-9蛋白強(qiáng)表達(dá)組5年生存率與弱表達(dá)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.019)；Cox多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)EphA2和MMP-9蛋白強(qiáng)弱表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　

8、 2.成功構(gòu)建了EphA2siRNA表達(dá)載體并且能高效轉(zhuǎn)入SGC-7901細(xì)胞內(nèi)。與陰性對照組比較，EphA2siRNA組中EphA2mRNA和蛋白表達(dá)沉默效率分別達(dá)到了73.4％和65.1％(P＜0.01)；與空白對照組和陰性對照組比較，EphA2siRNA組中細(xì)胞生長受到明顯抑制(P＜0.01)，同時(shí)細(xì)胞周期分布存在明顯差異，其中G0/G1期比例增高(P＜0.01)，而S期和G2/M期比例降低(P＜0.05)，細(xì)胞的增殖指數(shù)亦明顯

9、降低(P＜0.01)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降(P＜0.01)；同時(shí)EphA2siRNA組中MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá)也均顯著下降(P＜0.01)。
　　 3.成功建立胃癌SGC-7901細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，EphA2siRNA組移植瘤體積和瘤體重量均較空白對照組和陰性對照組下降(P＜0.01)，第一次治療后第21天EphA2siRNA組體積抑瘤率達(dá)47.5％?？瞻讓φ战M和陰性對照組中EphA2和MMP-9蛋白的表達(dá)均高

10、于EphA2siRNA組。
　　 結(jié)論：
　　 1.胃癌組織中EphA2和MMP-9的高表達(dá)不僅與胃癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也可作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　 2.EphA2siRNA表達(dá)載體能有效抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞EphA2mRNA及蛋白的表達(dá)。沉默EphA2在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞生長、增殖、遷移和侵襲以及MMP-9的表達(dá)。
　　 3.裸鼠移植瘤瘤