EphA2促進(jìn)胃癌SGC7901-AGS細(xì)胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的信號(hào)通路研究.pdf

1、背景:
　　侵襲轉(zhuǎn)移是進(jìn)展期胃癌患者死亡的主要原因，因此對(duì)進(jìn)展期胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有重要的意義。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelialmesenchymal transition，EMT)是多種實(shí)體性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的早期關(guān)鍵事件，也是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前的研究發(fā)現(xiàn)多種通路參與了惡性腫瘤的EMT，包括Wnt、Notch、TGF-β及MAPK等。Eph受體家族(erythropoietin-producing hepatoc

2、ellular receptors)是現(xiàn)已知的受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTKs）家族中最大的亞家族，在哺乳動(dòng)物中共有14個(gè)成員，是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子。EphA2受體是其中一員，其編碼基因定位于腫瘤“熱點(diǎn)”的染色體區(qū)域1p36.1，在多種腫瘤呈高表達(dá)和高度異?；罨?，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和治療預(yù)后相關(guān)。我們的前期研究顯示胃癌中EphA2可能參與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移，但EphA2調(diào)控胃癌E

3、MT的通路機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:
　　探討EphA2在胃癌EMT中的作用及其涉及的信號(hào)通路。
　　方法:
　　1、采用免疫組化法檢測(cè)115例胃癌患者癌組織和癌旁正常粘膜組織中EphA2、E-cadherin、Snai1、N-cadherin和β-catenin的表達(dá)情況。
　　2、構(gòu)建特異性EphA2 siRNA載體和EphA2過(guò)表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到胃癌SGC7901和AGS細(xì)胞。MTT法觀

4、察細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀的變化，劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。并用Realtime RT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測(cè)EMT特征性分子(Snai1、N-cadherin、E-cadherin)的表達(dá)情況。
　　3、用Wnt/β-catenin通路特異性抑制劑XAV-939處理SGC7901、AGS胃癌細(xì)胞及已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EphA2過(guò)表達(dá)載體的上述兩株胃

5、癌細(xì)胞。用Real time RT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)變化，Western blot、免疫熒光法檢測(cè)β-eatenin、GSK-3β及p-GSK-3βSer9蛋白表達(dá)變化、MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀的變化，劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。并用Real time RT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測(cè)EMT特征性分子(Snai1、

6、N-cadherin和E-cadherin)及Wnt/β-catenin通路靶基因c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達(dá)情況。
　　4、用Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl處理GC7901、AGS胃癌細(xì)胞及已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EphA2 siRNA的上述兩株胃癌細(xì)胞。用Real timeRT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)變化，Western blot、免疫熒光法檢測(cè)β-catenin、GSK-3β及p-GSK

7、-3βSer9蛋白表達(dá)變化、MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀的變化，劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。并用Realtime RT-PCR、Western Blot和免疫熒光法檢測(cè)E-cadherin、Snai1、N-cadherin、c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、與癌旁非癌胃粘膜組織相比，胃癌組織的EphA2、Snai1

8、和N-cadherin明顯高表達(dá)，β-catenin核表達(dá)明顯增多，E-cadherin明顯低表達(dá)。胃癌組織中EphA2表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)及TNM分期相關(guān);Snai1的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、TNM分期相關(guān);N-cadherin的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度相關(guān);E-cadherin的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)相關(guān);β-catenin的核表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)有關(guān)。Eph

9、A2與Snai1、N-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與β-catenin的核表達(dá)呈正相關(guān)。
　　2、EphA2過(guò)表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，S期和G2/M期比例增高，而G0/G1期比例降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。EphA2被siRNA抑制后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，細(xì)胞周期發(fā)生變化，G0/G1期比例增高，而S期和G2/M期比例降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低。顯微鏡下可見(jiàn)，

10、EphA2過(guò)表達(dá)之后，胃癌細(xì)胞（AGS和SGC7901）呈細(xì)長(zhǎng)、錐形改變，失去片狀圓形上皮樣細(xì)胞形態(tài)。EphA2過(guò)表達(dá)顯著降低了E-cadhrin的表達(dá)水平，并使Snai1及N-cadherin的表達(dá)水平升高;抑制EphA2后則使E-cadherin表達(dá)升高，Snai1及N-cadherin表達(dá)降低。
　　3、Wnt/β-catenin通路特異性抑制劑XAV939能明顯下調(diào)EphA2及p-GSK-3βSer9的表達(dá)，抑制SGC79

11、01和AGS細(xì)胞β-catenin核轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞生長(zhǎng);S期和G2/M期細(xì)胞減少，G0/G1期細(xì)胞增多，細(xì)胞侵襲能力下降;Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達(dá)下調(diào);Snai1、N-cadherin表達(dá)降低，E-cadherin的表達(dá)升高。同時(shí)EphA2過(guò)表達(dá)加入XAV-939后，能部分逆轉(zhuǎn)EphA2過(guò)表達(dá)對(duì)于胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及EMT的促進(jìn)作用。
　　4、Wnt/β-catenin

12、通路特異性激活劑LiCl能明顯上調(diào)EphA2及p-GSK-3βSer9的表達(dá)，促進(jìn)SGC7901和AGS細(xì)胞β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng);S期和G2/M期細(xì)胞增多，G0/G1期細(xì)胞減少，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng);Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白c-Myc、TCF-4和CyclinD1的表達(dá)升高;Snai1、N-cadherin的表達(dá)升高，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞形態(tài)呈明顯EMT變化。但是，同時(shí)EphA2沉默表達(dá)