蛋白質組學技術研究斑馬魚腦組織和肝細胞響應甲基對硫磷脅迫的關鍵蛋白質.pdf

1、甲基對硫磷(Methyl parathion，MP)由于具有藥效高、品種防治對象多等特點，成為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用最為廣泛的一類有機磷殺蟲劑。然而，過去幾十年來MP的過度使用，加之其本身的環(huán)境持久性，已造成其在水環(huán)境中的高濃度殘留，對水生生物的生存以及人類健康構成了巨大威脅。目前，已有大量關于MP生物毒性的研究報道，然而對于MP產(chǎn)生這些毒性的分子機制還不是很清楚。因此，本論文以MP為有機磷污染物，研究了MP對斑馬魚腦組織和肝(ZFL)

2、細胞的毒性效應，繼而采用蛋白質組學技術研究在MP脅迫下斑馬魚腦組織和ZFL細胞表達的差異蛋白，篩選出響應MP毒性的關鍵蛋白質，并從分子水平上初步探索MP的毒理機制。
　　 采用氣相色譜法分析MP在斑馬魚腦組織中的殘留量及其代謝產(chǎn)物。結果表明MP可迅速在腦組織中積累，而后經(jīng)歷緩慢的清除過程；其主要的代謝產(chǎn)物為對硝基苯酚。與其它有機磷農(nóng)藥的毒性類似，MP可顯著抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，并且其活性下降趨勢呈典型的劑量-時間效

3、應。兩種抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化表現(xiàn)為抑制-激活-抑制，而脂質過氧化物丙二醛(MDA)的含量變化趨勢正好與之相反，呈升高-降低-升高。說明MP對斑馬魚產(chǎn)生了氧化脅迫，CAT、SOD活性的激活過程則體現(xiàn)了機體在一定程度上抵抗氧化脅迫的自我保護機制。
　　 運用比較蛋白質組學技術，分析了MP脅迫下斑馬魚腦組織全蛋白質組表達的差異蛋白質。與對照組相比，僅發(fā)現(xiàn)6個蛋白差異表達。其中，4個蛋白(TU

4、BB5、CKBB、DPYSL3、GFAP)表達量下調，2個蛋白(HNRPDL、class1 beta tubulin)表達量上調，該結果顯然不利于我們全面地認識MP的毒理學機制。膜蛋白在生物體中負責執(zhí)行許多重要功能，并且是多數(shù)毒物作用的靶點。因此，膜蛋白可能是MP的主要作用目標。有鑒于此，我們進一步采用膜蛋白質組學技術研究MP脅迫下斑馬魚腦組織膜蛋白的差異表達情況，結果篩選出16個差異膜蛋白(8個表達量上調，8個表達量下調)。這些膜蛋白

5、的功能涉及氧化還原平衡(PDIA3、ALDH5Al)、信號轉導(GNB1L、GNB2、GDI2)、代謝(DLST、IDH3A、MDH)、蛋白質合成與降解(TUFM、UCHL1)及神經(jīng)發(fā)育與功能(ependymin、STXBP1)等多個方面。
　　 與組織水平相比，基于細胞水平的毒理學研究更有利于了解毒物毒性作用的信號通路并揭示其毒理機制。因此，本研究以ZFL細胞為研究對象，分析了MP對ZFL細胞的毒性作用，并采用膜蛋白質組學技術

6、研究MP暴露后ZFL細胞表達的差異膜蛋白，其結果可為今后深入研究MP的分子毒理機制提供一定的科學依據(jù)。
　　 細胞形態(tài)顯微觀察、MTT法等研究結果表明，MP顯著抑制ZFL細胞的增殖，且抑制率與MP濃度成正相關，其24h IC50為200μM。PI單染法和AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測結果揭示了MP可使ZFL細胞周期阻滯于S期，且MP導致ZFL細胞死亡的主要原因是誘導細胞的繼發(fā)性壞死或晚期凋亡，而不是早期凋亡

7、。膜蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在MP脅迫下ZFL細胞中8個膜蛋白的表達水平發(fā)生改變，其中6個表達量上調的蛋白為endoplasmin、HSP9、CD146、SDH、arginase-2、ACBD5A，2個表達量下調的蛋白為TUBA2和TRHR1L。對這些差異蛋白進行功能分類，可分為分子伴侶、細胞骨架、代謝、信號轉導、轉運和受體等。
　　 本研究通過藥物殘留及代謝產(chǎn)物測定、酶學測定、MTT法、流式細胞術等多種手段，分析了MP對斑馬魚腦組

8、織和ZFL細胞的毒性效應。在此基礎上，采用差異蛋白質組學技術篩選出斑馬魚腦組織和ZFL細胞響應MP脅迫的差異蛋白質。選用Western blotting分析MP脅迫前后DPYSL3、STXBP1和arginase-2的蛋白表達水平及quantitative real-time PCR分析蛋白相應的mRNA水平，結果再次驗證了這些蛋白的差異表達，提高了選用蛋白質組學技術篩選與鑒定MP誘導的差異蛋白質的可信度。利用生物信息學手段對所有差異蛋