蚯蚓蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的建立及菲脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本實驗通過對蚯蚓蛋白質(zhì)提取方法的比較,選擇合適的樣品制備方案,并對IPG膠條pH范圍,等電聚焦時間,上樣量等雙向電泳條件進行優(yōu)化,建立了適用于蚯蚓(Eisenia fetida)組織蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)條件。對蚯蚓進行菲的亞急性毒性試驗,采用建立的雙向電泳條件進行蚯蚓菲脅迫下蛋白質(zhì)差異表達分析,并對部分差異表達蛋白質(zhì)進行了種類鑒定,為后續(xù)開展蚯蚓蛋白質(zhì)組學(xué)研究以及菲污染脅迫下土壤生物標志物的篩選奠定了研究基礎(chǔ)。
　　 研究結(jié)果表

2、明,改良后的TCA/丙酮沉淀法比裂解液提取法提取蚯蚓組織蛋白質(zhì)效果更佳,雜質(zhì)去除能力更好,所得雙向電泳圖譜分辨率較高,更適用于蚯蚓組織全蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備。
　　 蚯蚓蛋白質(zhì)組雙向電泳的最佳條件為:組織通過改良的TCA/丙酮沉淀法提取總蛋白,選用pH范圍4～7的IPG膠條,考馬斯亮藍凝膠染色時最佳上樣量為600μg,等電聚焦時間10h。所得雙向電泳圖譜蛋白點豐富,背景清晰,可鑒定蛋白點超過450個。
　　 對蚯蚓進行

3、23mg/kg菲污染20d,30d和40d三個不同時間點的自然土壤亞急性毒性實驗,通過自行建立的雙向電泳技術(shù)條件對蚯蚓蛋白質(zhì)進行表達差異分析,分別獲得顯著性差異蛋白點14,22和35個,且差異蛋白表達下降趨勢明顯,并出現(xiàn)部分表達上調(diào)的蛋白質(zhì)。選取5個差異蛋白點進行質(zhì)譜分析,鑒定結(jié)果分別為ATP結(jié)合盒式蛋白,DNA修復(fù)酶RadA,磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶,帶4.1蛋白和一個未知功能蛋白,這些蛋白質(zhì)分別參與了免疫調(diào)控、遺傳修復(fù)、能量代謝以及細胞骨架