適用于小麥葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)體系的建立.pdf

1、樣品制各是決定2-DE分辨率和重復(fù)性的關(guān)鍵因素之一.在植物蛋白質(zhì)組研究中,植物組織由于本身特有的特點(diǎn),使其蛋白提取比動(dòng)物、微生物的更復(fù)雜,目前大多使用TCA/丙酮法提取植物組織總蛋白,但該法缺點(diǎn)是沉淀的蛋白復(fù)溶難及蛋白損失較多,建立適用于小麥葉片蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法勢(shì)在必行. 以小麥Taichung29苗期葉片為材料,首先通過單向SDS-PAGE篩選比較3種較簡單的蛋白樣品制各方法:TCA/丙酮法、改進(jìn)的酚提取-甲醇/醋酸

2、銨沉淀法及尿素/硫脲提取法提取法,然后選用蛋白丟失少的制備方法進(jìn)行雙向電泳分離和膠體考染,并選取代表性的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫比對(duì),分析評(píng)價(jià)其提取分離蛋白能力的差別,為抗條銹比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三種方法提取的小麥葉片蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后條帶數(shù)目、位置以及染色深淺均有較大差異.采用改進(jìn)的酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法及尿素/硫脲提取法提取的總蛋白,經(jīng)pH3-10/pH4-7IPG膠條等電聚焦,SDS

3、-PAGE分離,可檢測(cè)到較多的蛋白點(diǎn)數(shù),分別為1016±203、1014±281和1563±37、1555±280.在pH3-10范圍內(nèi),與尿素/硫脲提取法相比,酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法能較好地檢測(cè)到堿性區(qū)域的蛋白點(diǎn);尿素/硫脲提取法利于分子量大于70kDa的蛋白分離.在pH4-7范圍內(nèi),尿素/硫脲提取法在酸性端能分離出數(shù)個(gè)特異蛋白點(diǎn),與酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法相比,能相對(duì)較多的溶解分離出某些蛋白點(diǎn);酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法在高分