人肝細(xì)胞癌組織和組織間隙液的蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤之～，有較高的發(fā)病率和死亡率。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染是人HCC發(fā)生的最重要的危險(xiǎn)因素。特別在中國(guó)，絕大多數(shù)HCC患者是HBV感染陽(yáng)性。考慮到現(xiàn)在對(duì)HCC仍缺乏有效的診治手段，對(duì)HBV感染HCC的重要癌變相關(guān)分子進(jìn)行發(fā)掘仍然很迫切并且必要。 蛋白質(zhì)組學(xué)作為全面分析蛋白質(zhì)表達(dá)變化的有力研究工具，已廣泛應(yīng)用到疾病特別是腫瘤研究之中。在人類(lèi)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，人

2、體樣本是最有價(jià)值和說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)材料。樣本收集是重要的基礎(chǔ)工作，需要對(duì)樣本的入組選擇、采集方法、處理步驟、貯存條件以及信息登記等做詳細(xì)的規(guī)范，以期建立適用于蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的樣本庫(kù)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)HCC及其健康對(duì)照、乙型肝炎、肝硬化病人的各類(lèi)臨床樣本進(jìn)行了收集，包括血漿、血細(xì)胞、血清、尿液和組織。 定量分析是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要組成部分，對(duì)方法學(xué)有較高的要求，需要對(duì)生物樣品之間的蛋白質(zhì)差異表達(dá)值提供準(zhǔn)確和重復(fù)性

3、好的分析。DIGE是定量蛋白質(zhì)組學(xué)方面的一個(gè)進(jìn)步，與傳統(tǒng)2DE相比，DIGE可以提供更為準(zhǔn)確的定性和定量分析。首先對(duì)DIGE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3方面的評(píng)價(jià)：2DE重復(fù)性評(píng)價(jià)、標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和標(biāo)記評(píng)價(jià)，都獲得了較好的標(biāo)記和定量效果。然后利用DIGE技術(shù)分析了12例HBV感染HCC病人腫瘤組織和臨近非腫瘤肝組織的蛋白質(zhì)表達(dá)差異。在得到的2338個(gè)匹配點(diǎn)中，有61個(gè)點(diǎn)在腫瘤樣品中顯著上調(diào)，158個(gè)點(diǎn)顯著下調(diào)。經(jīng)MALDI-TOF-TOF分析，在61個(gè)上調(diào)點(diǎn)

4、中32個(gè)點(diǎn)得到鑒定，對(duì)應(yīng)于23種基因表達(dá)產(chǎn)物；158個(gè)下調(diào)點(diǎn)中，有77個(gè)點(diǎn)鑒定為50種基因表達(dá)產(chǎn)物。根據(jù)Swiss-Prot庫(kù)的注釋信息對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能和細(xì)胞定位分析。對(duì)部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了Westernblot驗(yàn)證，與DIGE結(jié)果有較好一致性。應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白／分子伴侶和與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白在HCC腫瘤組織中上調(diào)，與氨基酸代謝、脂類(lèi)代謝和生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70和90家族的幾種成員以及HOP蛋白在HCC

5、腫瘤組織中同時(shí)高表達(dá)，推測(cè)它們可能通過(guò)相互作用共同在HBV相關(guān)的致癌過(guò)程中發(fā)揮作用，而在HCV感染HCC中只報(bào)道了熱休克蛋白70家族成員的上調(diào)。線粒體和過(guò)氧化物酶體蛋白在HCC腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)，4種在肝臟中參與甲基化循環(huán)的代謝酶在HCC腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)。首次報(bào)道了在HCC腫瘤組織中不同形式的GAPDH和FTCD同時(shí)出現(xiàn)相反表達(dá)。首次在HCC組織中對(duì)HOP和hnRNPC1／C2的表達(dá)水平進(jìn)行了Westernblot驗(yàn)證，提示HOP和h

6、nRNPC1／C2可作為HCC組織的候選標(biāo)志物。 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過(guò)組織間隙液(TIF)這個(gè)微環(huán)境與周?chē)?xì)胞和血液等循環(huán)外液之間進(jìn)行著物質(zhì)和信息交換。在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也發(fā)揮了十分重要的作用。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的分泌蛋白或由于壞死破碎而釋放的細(xì)胞蛋白也會(huì)存在于這個(gè)微環(huán)境中，成為很好的腫瘤標(biāo)志物。因此，對(duì)TIF進(jìn)行研究，不僅會(huì)對(duì)腫瘤的發(fā)生機(jī)制提供有益的信息，還將為腫瘤標(biāo)志物的尋找提供新的思路。我們建立了大鼠肝臟以

7、及正常成人肝臟TIF的提取方法。該方法經(jīng)過(guò)了以線粒體蛋白COXIV和CytoC、細(xì)胞質(zhì)膜蛋白flotillin—l以及胞漿蛋白caspase-3等亞細(xì)胞器蛋白進(jìn)行的污染評(píng)價(jià)；對(duì)成人正常肝臟TIF進(jìn)行了蛋白質(zhì)得率的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，選擇lh作為T(mén)IF的孵育時(shí)間。對(duì)TIF進(jìn)行2DE展示，表明TIF的蛋白質(zhì)構(gòu)成與組織細(xì)胞和血漿均有較大的區(qū)別，具有獨(dú)特性。對(duì)正常成人肝臟TIF進(jìn)行SDS-PAGE分離加Q-TOF鑒定全譜分析，鑒定了460種蛋白質(zhì)，其中包

8、含了與細(xì)胞通訊、識(shí)別、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、骨架蛋白裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。對(duì)鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量、pI值分布分析，結(jié)果表明：鑒定蛋白質(zhì)的pI值為4～12，密集區(qū)為6～7；分子量跨度從7836Da～532072Da，多數(shù)蛋白小于100kDa，尤其集中于20～30kDa(21．7％)。為我們以后對(duì)其分析時(shí)的方法學(xué)選擇提供了有益的參考。對(duì)鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明：TIF中存在較多細(xì)胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，它們的存在可能與胞吐、

9、胞吞、分泌、細(xì)胞膜囊泡脫落過(guò)程以及細(xì)胞降解產(chǎn)物的釋放有關(guān)。將鑒定蛋白質(zhì)與HPPP數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，僅有63種TIF蛋白質(zhì)能在血漿中找到(占TIF中蛋白質(zhì)總數(shù)的14％)，表明與血漿相比，TIF中有更高濃度的組織局部蛋白，包含了更多的信息，提示TIF可能是一種更具潛力的尋求疾病相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物的分析材料。之后，對(duì)l例HCC病人的腫瘤一非腫瘤肝臟TIF進(jìn)行了差減分析，在lO種高可靠性的差異蛋白中，有6種已報(bào)道在HCC中上調(diào)表達(dá)，證明了分析方法的可