水牛卵母細胞及卵泡液蛋白質(zhì)組的初步研究.pdf

1、本研究以水牛卵母細胞和卵泡液為實驗材料，通過雙向電泳、液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)分析卵母細胞體外成熟過程中以及卵泡在發(fā)育過程中蛋白質(zhì)表達的差異性。論文共包括兩部分，第一部分為文獻綜述部分，第二部分為研究部分。
　　 研究一：本試驗以水牛卵母細胞為對象，通過采用雙向凝膠電泳的方法來建立和優(yōu)化水牛卵母細胞雙向凝膠電泳的條件，并對比分析卵母細胞成熟前后蛋白質(zhì)表達的差異性。結(jié)果顯示：裂解液A(7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS和0.5%DTT

2、)提取的總蛋白采用pH4～7、13 cm IPG膠條上能夠清晰得到水牛卵母細胞雙向電泳圖譜。成熟前后卵母細胞蛋白雙向電泳圖譜經(jīng)Image Master軟件對比分析，檢測出約300個蛋白質(zhì)點，并發(fā)現(xiàn)水牛卵母細胞成熟前后共存在27個差異蛋白，其中成功鑒定了8個蛋白質(zhì)，包括HSP60蛋白，HSC71蛋白，MVP蛋白，GEMIN8蛋白等。說明雙向電泳技術(shù)可以用于水牛卵母細胞生長發(fā)育成熟分子機理的研究。成功鑒定的這些在成熟后表達上調(diào)的差異蛋白質(zhì)可

3、以作為水牛卵母細胞發(fā)育成熟的潛在標記物。
　　 研究二：本試驗是以水牛卵泡液為研究對象，通過采用雙向凝膠電泳的方法來建立和優(yōu)化水牛卵泡液雙向凝膠電泳的條件，為以后研究卵泡液發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的變化奠定基礎。結(jié)果顯示：TCA/丙酮沉淀法處理得到的總蛋白，當采用24 cm、pH3～10非線性(Nonlinear，NL)膠條及上樣量為150μg時，可獲得較好的卵泡液總蛋白質(zhì)2-DE圖譜；運用Image Master2D platinum

4、分析軟件檢測出約300個蛋白質(zhì)點。
　　 研究三：以水牛卵泡液為試驗材料比較不同直徑水牛卵泡液(直徑<4mm、直徑4～8mm、直徑>8mm)的蛋白質(zhì)和多肽表達變化。試驗一：采用基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)建立水牛卵泡液的多肽表達模型。結(jié)果表明：三種形態(tài)的卵泡液存在12個顯著差異多肽，其中在大卵泡內(nèi)上調(diào)6個，下調(diào)有2個。其中分子量1746Da的多肽在大卵泡中特異性表達，可作為卵泡成熟的潛在生

5、物標志物之一。試驗二：采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分離鑒定技術(shù)，經(jīng)過液相色譜分離并收集顯著差異的餾分，還原烷基化處理后酶解成肽段，再經(jīng)反相色譜二次分離后質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明，在大卵泡中存在顯著高表達的蛋白質(zhì)峰，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，TRF)。該蛋白質(zhì)的高表達可作為潛在排卵的標志物之一。同時，本研究采用的LC-MS技術(shù)將為卵泡液大規(guī)模蛋白質(zhì)組分離和表達譜構(gòu)建打下實驗基礎。
　　 綜上所述，本研究建立了水