牛卵泡卵母細(xì)胞冷凍保存的研究.pdf

1、　　本試驗以屠宰場廢棄牛卵巢為材料，從卵巢表面直徑在2～8mm的卵泡中抽取卵泡液，并從卵泡液中分揀出外被多層卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)作為研究的對象。本試驗首先對影響牛COCs冷凍的一些因素進(jìn)行了探討，然后用熒光染色的方法分析了冷凍對COCs減數(shù)分裂進(jìn)程的影響。1影響牛COCs冷凍保存的一些因素的研究　　試驗首先在簡化牛COCs體外成熟的基礎(chǔ)上分析了保護劑、平衡溫度、預(yù)平衡方法、解凍方法以及冷凍方法對牛COCs冷凍的影響

2、。結(jié)果表明：(1)在體外成熟培養(yǎng)液中添加26.2mM的NaHCO3和對屠宰場卵巢進(jìn)行一定的選擇更能促進(jìn)牛COCs的體外成熟；(2)無論是程序冷凍還是玻璃化冷凍，乙二醇(EG)與甘油(GLY)相比更能增強牛COCs的冷凍效果；(3)在程序冷凍中，冷凍液中添加0.1M的蔗糖比添加0.3M的蔗糖更能增強牛COCs的冷凍效果；(4)在玻璃化冷凍中，38.5℃和25℃的平衡溫度比4℃更適合牛COCs的冷凍；(5)在10﹪、5﹪、1﹪的預(yù)平衡濃度之

3、間，5﹪的預(yù)平衡濃度即可達(dá)到預(yù)平衡的效果；(6)在解凍時，多步脫除保護劑較一步脫除法更能保護冷凍后的COCs?！　≡囼炌ㄟ^熒光染色的方法建立了卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中第一次減數(shù)分裂的各個階段的判斷標(biāo)準(zhǔn)；然后根據(jù)這個標(biāo)準(zhǔn)來觀察GMP玻璃化冷凍對卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂進(jìn)程的影響。說明從屠宰場獲得的卵母細(xì)胞有較高的異質(zhì)性。體外培養(yǎng)8h后，冷凍組到達(dá)中期(MⅠ)的卵母細(xì)胞顯著少于對照組(未冷凍組)(P＜0.01)，其他階段的卵母細(xì)胞沒有顯著的

4、差異；體外培養(yǎng)15h后，冷凍組顯著低于對照組，另外，對照組有36.11﹪的卵母細(xì)胞到達(dá)了后期(AⅠ)和第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)，而冷凍組僅6.67﹪的卵母細(xì)胞到達(dá)MⅡ期。體外培養(yǎng)22h后，對照組中有55.56﹪的卵母細(xì)胞處于MⅡ期，極顯著高于冷凍組，而冷凍組中24.32﹪的卵母細(xì)胞停止于濃縮期，顯著高于對照組的5.56﹪(P＜0.05)。從兩組第一次減數(shù)分裂的差異可以看出，冷凍不影響正常的生發(fā)泡破裂，但大多冷凍的卵母細(xì)胞無法完成濃縮期