南陽(yáng)牛卵泡卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的研究.pdf

1、南陽(yáng)牛是我國(guó)五大黃牛良種之一，有著十分重要的保種和育種價(jià)值。以南陽(yáng)牛卵泡卵母細(xì)胞為材料通過(guò)體外成熟培養(yǎng)和體外受精技術(shù)建立南陽(yáng)牛胚胎基因庫(kù)是進(jìn)行南陽(yáng)牛保種的一個(gè)新途徑。但是，迄今為止還未見(jiàn)到對(duì)南陽(yáng)牛體外受精技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性研究的報(bào)道。本研究以屠宰后南陽(yáng)牛的卵巢為材料，用抽吸法收集卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母細(xì)胞，通過(guò)體外成熟、體外受精及受精卵體外培養(yǎng)的研究，探討了影響南陽(yáng)牛體外受精的因素。建立了適合南陽(yáng)牛胚胎體外生產(chǎn)的可行性程序。試驗(yàn)結(jié)果

2、如下： 1.探討了卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞層數(shù)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟和發(fā)育潛力的影響。結(jié)果顯示，具有2～8層卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞的第一極體率(87.5％)、卵裂率(74.2％)和囊胚率(35.1％)均顯著的高于8層以上組、2層以下組和裸卵組；2層以下組的第一極體率(67.5％)、卵裂率(48.8％)和囊胚率(23.8％)，顯著高于8層以上組和裸卵組；裸卵組的效果最差，囊胚率為0％。 2.卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22h以上時(shí)卵母細(xì)胞的第一

3、極體率(87.5％、87.5％)雖然高于培養(yǎng)18～22h組，但是，卵裂率(41.3％、24.3％)和囊胚率(26.3％、11.1％)均明顯低于培養(yǎng)18～22h組(75.3％、36.2％)，差異極顯著(P＜0.01)；培養(yǎng)18h以下時(shí)，卵母細(xì)胞的第一極體率、卵裂率和囊胚率顯著降低。 3.在培養(yǎng)液中添加10％的OCS，卵母細(xì)胞的第一極體率(87.5％)、卵裂率(74.2％)和囊胚率(35.1％)最高，與添加FCS組和BSA組之間差異

4、極顯著(P＜0.01)；添加FCS組的第一極體率，卵裂率和囊胚率與添加BSA組之間差異極顯著(P＜0.01)；添加BSA組的第一極體率(52.5％)、卵裂率(32.9％)和囊胚率(15.6％)最低。 4.比較了成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)液中添加0％(對(duì)照組，添加10％FCS)、10％、20％、30％、40％BFF對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明，添加10％、20％BFF組的卵母細(xì)胞第一極體率(82.5％、85.0％)、卵裂率(76.9％、7

5、7.9％)及囊胚率(30.1％、35.8％)顯著高于對(duì)照組、30％和40％組。卵泡液的濃度增加到30％和40％時(shí)與添加20％組相比卵母細(xì)胞的第一極體率和卵裂率分別降低了42.5、75.0和44.9、64.0個(gè)百分點(diǎn)，但添加30％組的囊胚率比添加20％組提高了5.3個(gè)百分點(diǎn)。 5.在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中分別單獨(dú)添加FSH、LH、E2與對(duì)照組相比，對(duì)卵母細(xì)胞的第一極體率、卵裂率和囊胚率的影響各組之間差異不顯著(P＞0.05)；添加復(fù)

6、合激素E2+FSH+LH對(duì)卵母細(xì)胞的第一極體率和卵裂率沒(méi)有明顯的影響，但添加復(fù)合激素E2+FSH+LH時(shí)卵母細(xì)胞的囊胚率顯著的其他各組(P＜0.01)。 6.用直接離心法、Percoll密度梯度離心法和上浮法處理的南陽(yáng)牛精子進(jìn)行體外受精，受精后的卵裂率分別為53.9％、49.5％、54.1％，三者差異不顯著；用Percoll密度梯度離心法和上浮法處理的南陽(yáng)牛精子進(jìn)行受精后的囊胚率(37.5％、37.1％)與直接離心法得到的囊胚率

7、(20.7％)之間差異極顯著(P＜0.01)。 7.比較了用BO液和改良臺(tái)氏液做為受精液對(duì)卵母細(xì)胞體外受精的影響，結(jié)果表明，改良臺(tái)氏液組的卵裂率和囊胚率均顯著高于BO液(54.4％VS50.7％、34.0％VS29.6％)。 8.以TCM199或mSOF做為受精卵基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行受精卵的體外培養(yǎng)。結(jié)果表明兩種培養(yǎng)系統(tǒng)所得的卵裂率(52.1％VS53.0％)和囊胚率(32.3％、VS31.5％)均無(wú)顯著差異(p＞0.05)。

8、 9.用輸卵管上皮細(xì)胞單層(BOECM)培養(yǎng)系統(tǒng)和顆粒細(xì)胞單層(GCM)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行受精卵的體外培養(yǎng)，所得的卵裂率(53.1％、52.0％)和囊胚率(30.2％、33.5％)差異均不顯著(P＞0.05)，但BOECM系統(tǒng)所得囊胚發(fā)育率(33.5％)稍高于GCM組(30.2％)。結(jié)果表明，輸卵管上皮細(xì)胞單層和顆粒細(xì)胞單層均可用于南陽(yáng)牛體外受精胚胎的體外培養(yǎng)。 上述結(jié)果為提高南陽(yáng)牛卵泡卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精效果積累了科學(xué)