雞初級(jí)卵母細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及冷凍保存的研究.pdf

1、禽類的卵巢皮層中含有大量的初級(jí)卵母細(xì)胞，能分離得到大量的形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整的初級(jí)卵母細(xì)胞至關(guān)重要，它是體外培養(yǎng)的第一步。運(yùn)用酶分離法，人們已經(jīng)從火雞的卵巢上分離得到初級(jí)卵母細(xì)胞，但類似的工作在雞上還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過胰蛋白酶與膠原酶混合處理或單獨(dú)處理的方式分離性成熟雞的卵巢皮層中的初級(jí)卵母細(xì)胞。結(jié)果表明：將胰蛋白酶(0.15％)與膠原酶(1.20mg/ml)混合消化性成熟雞卵巢皮層20min，從雞的一個(gè)卵巢中能獲得數(shù)量400左右，直徑

2、在60～1125μm的初級(jí)卵母細(xì)胞；其中76.5％的初級(jí)卵泡形態(tài)正常，帶有完整的顆粒細(xì)胞層，外包基膜與殼膜。分離卵泡的直徑多集中于200～500μm之間；胰蛋白酶(0.15％)消化得到的主要為大卵泡(直徑＞250μm)，膠原酶(1.20mg/ml)消化得到的主要是小卵泡(直徑＜250μm)。顯微鏡下觀察分離后的初級(jí)卵母細(xì)胞形態(tài)正常，呈球形或橢圓形，胞質(zhì)均勻，其生發(fā)泡完整；電鏡分析其超微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)含有橢圓形或紡錘形的線粒體、

3、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及大量的卵黃顆粒；卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞呈立方體狀緊貼于卵母細(xì)胞膜表面，顆粒細(xì)胞膜完整，核巨大，胞質(zhì)內(nèi)含許多橢圓形線粒體、高爾基體等細(xì)胞器。卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及其分布正常，沒有看到明顯的分離操作的傷害。 用TCM199培養(yǎng)液(含10％FBS、2％雞血清、0.1％PVA、0.22mmol/L丙酮酸鈉、2mmol/L谷氨酰胺、青霉素100IU/ml和鏈霉素100μg/ml)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔

4、100μl的培養(yǎng)液條件下，對(duì)雞初級(jí)卵泡進(jìn)行了體外培養(yǎng)。結(jié)果表明：初級(jí)卵泡在培養(yǎng)板貼壁生長(zhǎng)，顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞從卵泡上伸出，在卵母細(xì)胞周圍形成細(xì)胞層向外擴(kuò)散，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，卵母細(xì)胞的形狀發(fā)生改變，由圓球變得扁平。直徑＜200μm的初級(jí)卵泡在培養(yǎng)24h后卵泡膜冒泡，胞漿破裂；直徑在300-500μm的初級(jí)卵泡直徑增長(zhǎng)、繼續(xù)存活率高于其他直徑(200～300μm，＞500μm)的初級(jí)卵泡，直徑平均增長(zhǎng)100μm，生存至13天。為了研究FS

5、H在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，在培養(yǎng)液中添加了一定濃度的FSH，結(jié)果顯示，當(dāng)FSH為30ng/ml，作用3天時(shí)，作用效果最強(qiáng)，卵泡雌二醇分泌量達(dá)到11.35ng/ml；另外，運(yùn)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)對(duì)生長(zhǎng)13天的初級(jí)卵泡進(jìn)行了細(xì)胞凋亡檢測(cè)，結(jié)果表明，培養(yǎng)液中加入FSH，一定程度上抑制了顆粒細(xì)胞的凋亡。我們將初級(jí)卵泡在顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)，其生存率高于對(duì)照組培養(yǎng)的卵泡，體外生存達(dá)到19天；不論有無飼養(yǎng)層，每孔3個(gè)卵泡共同培養(yǎng)，卵泡

6、雌二醇分泌量、生存率都高于每孔1個(gè)、2個(gè)、4個(gè)培養(yǎng)的初級(jí)卵泡，說明3個(gè)卵泡共同培養(yǎng)有利于卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)培養(yǎng)第5天、第13天的初級(jí)卵泡電鏡觀察表明：培養(yǎng)中的初級(jí)卵母細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜有很好的發(fā)展，線粒體從生發(fā)泡移向胞質(zhì)邊緣，呈線粒體環(huán)分布，其形狀也發(fā)生很大變化，由橢圓變?yōu)槔L(zhǎng)的棒狀、啞鈴狀、L狀，嵴發(fā)達(dá)，基質(zhì)電子密度深；還有戴帽線粒體出現(xiàn)，這與生長(zhǎng)時(shí)期的能量代謝有關(guān)。高爾基體數(shù)量較少，但形狀典型；培養(yǎng)13天的初級(jí)卵泡中發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞膜

7、上有微絨毛出現(xiàn)，這是放射冠的雛形。 生長(zhǎng)分化因子-9(GDF-9)是卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中重要的調(diào)控因子之一，在哺乳動(dòng)物中已被廣泛研究。亦有研究表明，禽類卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育中也存在GDF-9的調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)探討了GDF-9在體外培養(yǎng)的初級(jí)卵泡表達(dá)與定位。利用RT-PCR方法，檢測(cè)到體外培養(yǎng)5天的初級(jí)卵母細(xì)胞中表達(dá)GDF-9基因，用WesternBlot技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)到了GDF-9蛋白在卵母細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。通過免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)GDF-9

8、的表達(dá)緊鄰顆粒細(xì)胞層，分布在卵母細(xì)胞質(zhì)的外緣。由此證明，在體外培養(yǎng)的初級(jí)卵泡中也有GDF-9的表達(dá)，它對(duì)早期卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育起一定的調(diào)控作用。 采用OPS玻璃化冷凍法，對(duì)雞初級(jí)卵母細(xì)胞的冷凍保存進(jìn)行了初步的研究。將雞初級(jí)卵母細(xì)胞培養(yǎng)0h、12h、24h后，冷凍-解凍，體外繼續(xù)培養(yǎng)86h，結(jié)果顯示，直接冷凍的卵母細(xì)胞繼續(xù)生存率高于培養(yǎng)12h、24h后冷凍-解凍的卵母細(xì)胞(P＜0.05)。通過對(duì)冷凍后初級(jí)卵泡的電鏡觀察，培養(yǎng)不同時(shí)間的

9、卵母細(xì)胞冷凍后表現(xiàn)為不同程度的結(jié)構(gòu)損傷：未經(jīng)培養(yǎng)直接冷凍-解凍的卵母細(xì)胞受損傷的部位主要在基膜層，其層內(nèi)出現(xiàn)空泡，其它細(xì)胞器基本保持正常的結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)12h后冷凍-解凍的卵母細(xì)胞受損傷最大，主要表現(xiàn)在顆粒細(xì)胞排列紊亂，與卵母細(xì)胞膜分離，部分線粒體膨脹，電子密度稍降，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，脂滴形態(tài)異常。培養(yǎng)24h后冷凍-解凍的卵母細(xì)胞，脂滴形態(tài)稍發(fā)生改變，其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見異常。冷凍使得卵母細(xì)胞中的脂滴聚集。所以冷凍保存雞初級(jí)卵母細(xì)胞選擇新鮮分離的