水牛卵母細胞體外成熟與凋亡的初步研究.pdf

1、為進一步完善水牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系，對水牛卵母細胞體外成熟的影響因素，卯母細胞體外成熟和受精過程中的皮質顆粒變化規(guī)律，以及體外成熟過程中卵母細胞和顆粒細胞的凋亡情況進行了系統(tǒng)研究。本文分別以第一極體的排放和皮質顆粒(cortical granules，CGs)單層分布于質膜下作為水牛卵母細胞核、質成熟的指標對表皮生長因子(EGF)和胰島素樣生長因子(IGF-I)對水牛卵母細胞體外成熟的影響進行了研究。結果發(fā)現(xiàn):(1)在成熟基礎液中

2、添加10、20、30 ng/mL EGF對水牛卵母細胞的成熟率無明顯影響，但EGF濃度升高到50 n/mL時，水牛卯母細胞第一極體排出率顯著提高(55.4％vs 32.3％，P<0.05)，當EGF濃度升高到100 ng/mL時，卵母細胞的成熟率下降；CGs的分布隨著EGF濃度的升高逐步由中間分布向皮層分布轉變，EGF濃度為50 ng/mL時皮層分布的卵母細胞比例最高，當EGF濃度升高到100 ng/mL時，CGs又向中間分布轉變。(2

3、)在成熟液中添加10 ng/mL的IGF-I對水牛卵母細胞體外成熟無顯著影響(P>0.05)；但添加30 ng/mL的IGF-I能顯著提高水牛卵母細胞體外成熟率(P<0.05)，CGs的分布隨著IGF-I濃度的升高逐步由中間分布向皮層分布轉變，IGF-I濃度為30 ng/mL時，皮層分布的卵母細胞比例最高，隨著IGF-I濃度的進一步升高(50、100 ng/mL)，CGs又向中間分布轉變。(3)成熟基礎液中添加20 ng/mL EGF+

4、30 ng/mL IGF-I的卵母細胞體外成熟率顯著高于添加20 ng/mL EGF組和對照組(P<0.05)。以上結果表明，適宜濃度的EGF和IGF-I對水牛卵母細胞體外成熟具有促進作用，且兩者具有協(xié)同作用。 文中研究了水牛卵母細胞在體外成熟及體外受精過程中的CGs變化規(guī)律。用FITC-LCA標記不同體外成熟時間、體外受精時間的水牛卯母細胞的CGs，然后用激光共聚焦顯微鏡檢測其分布情況。結果發(fā)現(xiàn)，CGs在水牛卵母細胞體外成熟培

5、養(yǎng)前，70.1％卵母細胞的CGs呈現(xiàn)中間分布，體外成熟16 h后，CGs呈皮層分布的卯母細胞比例增多，達到22.1％。培養(yǎng)24 h后，CGs皮層分布的卯母細胞達到59.8％，分布形式由完全聚合向完全分散逐步轉變。對不同體外成熟時間的卵母細胞進行體外受精時發(fā)現(xiàn)，體外成熟12 h的卵母細胞僅在受精后3 h有12.9％的CGs外排。成熟20 h的卵母細胞在受精后1.5 h有48.5％的CGs外排，成熟24 h的卵母細胞受精后1.5 h的CGs

6、外排率可達到97.1％，3 h后達100％。同時也對化學激活后水牛卵母細胞的CGs分布情況進行了測定，發(fā)現(xiàn)化學激活也可以引起CGs的排放，體外成熟12 h的卵母細胞僅在激活后3 h有10.O％的CGs外排。成熟20 h的卵母細胞激活后0.5 h沒有CGs外排，激活后1.5 h CGs外排僅達到33.3％，明顯低于受精。體外成熟24 h的卵母細胞在激活后1.5 h CGs外排率可達到96.7％。以上結果表明，隨著成熟時間的延長，CG的分布

7、由中間分布逐漸向皮層分布轉變，受精和激活后的CG排放速度與卵子本身的成熟度有著直接的關系，且化學激活引起的CGs排放速度比體外受精遲緩。研究了EGF和IGF-I對水牛卵母細胞成熟培養(yǎng)過程中凋亡的影晌。結果發(fā)現(xiàn)，(1)在成熟基礎液中添加不同濃度的EGF(10、20、30、50、100ng/mL)都可以降低卵母細胞的凋亡率；添加20 ng/mL EGF的卵母細胞凋亡率為10.9％，顯著低于對照組(29.4％，P<0.05)；隨著EGF濃度的

8、提高，卵母細胞的凋亡率隨之下降，當EGF濃度添加至50 ng/mL時，卵母細胞凋亡率達到6.2％，顯著低于對照組和10 nggmL組(P<0.05)，與其它實驗組無顯著差異(P>0.05)。(2)在成熟基礎液中添加10，30，50和100 ng/mL的IGF-I，卵母細胞凋亡率(8.2％，7.6％，10.6％和15.4％)均顯著低于對照組(36.4％，P<0.05)，其中100 ng/mL組的卵母細胞凋亡率顯著高于10ng/mL組和30

9、 ng/mL組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著，(P>0.05)。(3)添加20 ng/mL EGF+30 ng/mL IGF-I組體外成熟卵母細胞的凋亡率低于添加30 ng/mL的IGF-I組和添加20 ng/mLEGF組以及對照組(P<0.05)。(4)在添加有20 ng/mL EGF+30 ng/mL IGF-I的成熟液中成熟培養(yǎng)12 h、20 h和24 h的的卯母細胞成熟率分別為7.8％、50.9％和61.4％，卵母細胞凋

10、亡率分別為1.7％、4.4％和4.7％，成熟差異顯著(P<0.05)，而凋亡率差異不顯著(P>0.05)。以上結果表明，適宜濃度的EGF和IGF-I可抑制水牛卵母細胞體外成熟過程中的凋亡發(fā)生，且兩者具有協(xié)同作用。 探討了卵母細胞發(fā)育潛能與卵丘顆粒細胞凋亡之間的關系。結果發(fā)現(xiàn):隨著卵母細胞成熟時間的延長，凋亡率升高；隨著卯母細胞評分和發(fā)育潛能的降低，顆粒細胞凋亡率逐漸升高。由此表明，卯母細胞發(fā)育潛能與卵丘顆粒細胞凋亡密切相關。通過