轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白基因四聚體綿羊成纖維細(xì)胞株的篩選.pdf

1、目前已知最為堅韌且有彈性的天然動物纖維之一——蜘蛛絲具有其它天然和人工材料無法比擬的超強(qiáng)剛性和出色的彈性。但由于蜘蛛無法高密度集群飼養(yǎng)而使得該方法無法大量獲得蜘蛛絲。因此，本研究根據(jù)綿羊自身產(chǎn)生毛發(fā)角蛋白的特性，將人工合成的蜘蛛絲蛋白基因四聚體與綿羊毛發(fā)角蛋白啟動子相連構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)染綿羊皮膚成纖維細(xì)胞，通過G418篩選含有neo抗性基因的陽性細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)拖絲蛋白基因四聚體細(xì)胞株。為建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，并通過體細(xì)胞核移植進(jìn)一步產(chǎn)生轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲

2、蛋白基因的克隆羊研究打下堅實基礎(chǔ)。研究結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1、綿羊角蛋白基因啟動子的克隆:參照GenBank中啟動子序列，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，依次克隆到中間絲角蛋白基因啟動子(K2.10)、高甘氨酸/酪氨酸蛋白基因啟動子(KAP6.1)和高硫角蛋白基因啟動子（B2A和B2C）;
　　2、綿羊角蛋白基因啟動子的表達(dá)活性:將上述啟動子與GFP報告基因連接，轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞。結(jié)果表明:中間絲角蛋白K2.10基因啟動子、高甘氨酸

3、/酪氨酸角蛋白KAP6.1基因啟動子及高硫角蛋白B2C基因啟動子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，檢測到綠色熒光蛋白的表達(dá)，而高硫角蛋白B2A基因啟動子未檢測到GFP熒光。選擇K2.10用于真核表達(dá)載體的構(gòu)建;
　　3、綿羊角蛋白基因啟動子真核表達(dá)載體的構(gòu)建:將K2.10啟動子與去除自身的CMV病毒啟動子的pcDNA3.1載體連接，獲得具有綿羊角蛋白基因啟動子的真核表達(dá)載體;
　　4、拖絲蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建:將四聚化絲蛋白基因與綿羊

4、角蛋白基因啟動子真核表達(dá)載體相連接，通過特異性引物將四聚體絲蛋白及角蛋白啟動子K2.10部分?jǐn)U增后連接到去除自身CMV病毒啟動子的pIRES2-EGFP載體上，獲得拖絲蛋白基因真核表達(dá)載體，并對其線性化;
　　5、成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選:采用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染線性化的拖絲蛋白基因真核表達(dá)載體于原代培養(yǎng)的綿羊皮膚成纖維細(xì)胞中，利用G418篩選獲得neo基因的抗性細(xì)胞;
　　6、對neo基因抗性細(xì)胞的鑒定:對G418篩選獲得的抗