重組人成纖維細胞生長因子-8a的純化研究.pdf

1、成纖維細胞生長因子-8a(fibroblast growth factor-8a, FGF8a)是成纖維細胞生長因子家族(fibroblast growth factor family, FGFs家族)的第8個成員FGF8的a亞型,不僅是胚胎發(fā)育階段必需的細胞調(diào)節(jié)因子,更有多種生物學功能,能夠高效安全地促進組織損傷的修復,還在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中起重要的營養(yǎng)和誘導作用,因此具有廣闊的臨床應用前景。重組人FGF8a(recombinant

2、 human fibroblast growth factor-8a,rhFGF8a)是將人FGF8a基因經(jīng)過體外改造克隆后以生物工程菌表達得到的多肽,具有與天然FGF8a相同的活性。同時,與從天然動物組織中提取的FGF8a相比,更具有產(chǎn)量高、成本低,資源豐富等優(yōu)點。本研究采用前期已經(jīng)構(gòu)建成功的FGF8a-pET28a-Rosetta作為表達菌株,經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside

3、,IPTG)誘導、菌體破碎后發(fā)現(xiàn),在可溶和不可溶的胞質(zhì)組分當中,均有rhFGF8a的存在。但通過嘗試多種純化方式發(fā)現(xiàn),以可溶形式表達的目的蛋白難以純化,而以包涵體形式表達的rhFGF8a只需經(jīng)過一次鎳柱親和層析便可以獲得純度高達95%以上的目的蛋白。本文還通過平行對比實驗,對rhFGF8a的復性條件進行優(yōu)化。實驗結(jié)果證明,FGF8a稀釋到50μg/ml,在pH值為8.0,添加了氧化/還原型谷胱苷肽的復性緩沖液里的復性效果最好。將純化后的

4、蛋白用MTT法進行細胞活性檢測,結(jié)果顯示,FGF8a對成纖維細胞具有一定的促增長作用。ED50約為50ng/ml。rhFGF8a的等電點為10.5,是一種強堿性蛋白,不利于純化。按一般經(jīng)驗,蛋白質(zhì)在帶負電荷時復性效果較好,但對于等電點高達10.5的rhFGF8a而言,這是不可行的。本研究通過對各種條件的摸索,在蛋白帶正電荷的情況下,成功地獲得了純度達95%以上并具有一定生物活性的rhFGF8a蛋白。這對其它強堿性蛋白的純化起到了一定的參