山羊耳尖成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的研究.pdf

1、2006年，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Inducedpluripotentstemcells，iPSCs)被日本東京大學(xué)的Takahashi和Yamanaka發(fā)現(xiàn)，由于其與胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCells，ES)存在相似的自我更新和分化潛能，且不涉及倫理問題。因此，在臨床治療等方面具有廣闊的研究前景并迅速成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　本試驗(yàn)以山羊?yàn)椴牧戏蛛x山羊耳尖成纖維細(xì)胞(Goatearfibroblast，GEF)，并通過多

2、順反子慢病毒系統(tǒng)和可誘導(dǎo)慢病毒系統(tǒng)嘗試重編程GEF為山羊iPS細(xì)胞，優(yōu)化山羊iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。結(jié)果如下:
　　1.通過組織塊貼壁法成功分離得到GEF，通過酶消化法分離C57/BL6小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MouseEmbryonicFibroblast，MEF)。絲裂霉素C處理MEF和GEF，制備飼養(yǎng)層。
　　2.慢病毒載體與包裝載體共轉(zhuǎn)293t細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝，48h后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)，收集慢病毒上清液并

3、測定滴度。多順反子慢病毒plentG-KOSM滴度為105～6TU/ml，用Millipore的100KD濃縮柱使其滴度達(dá)到106～7TU/ml;而可誘導(dǎo)慢病毒系統(tǒng)包裝病毒的滴度為106～7TU/ml。
　　3.兩套慢病毒系統(tǒng)分別感染GEF，在不同飼養(yǎng)層條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果顯示，只有在MEF作為飼養(yǎng)層的條件下誘導(dǎo)得到疑似iPS克隆，且只有可誘導(dǎo)慢病毒組獲得可以增殖的疑似山羊iPS克隆。
　　4.山羊iPS細(xì)胞生物學(xué)特性檢

4、測:
　　1)對得到的疑似山羊iPS細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色及Tra-1-60，Tra-1-81，REX-1和SSEA-1免疫熒光染色，染色結(jié)果均呈陽性。
　　2)提取疑似山羊iPS細(xì)胞RNA，RT-PCR檢測一些相關(guān)的ES細(xì)胞標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)Rex1、CDH1、Dnmt3b、TDGF、內(nèi)源性Sox2及Oct4。
　　3)對多能基因Nanog啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果表明Nanog基因啟動子在山羊iPS細(xì)胞中大