Piwil2重編程兒童成纖維細胞形成腫瘤干細胞的初步研究.pdf

1、目的: 觀察精原干細胞自我更新基因Piwil2重編程兒童成纖維細胞的細胞形態(tài)及功能特征變化，建立Piwil2調控腫瘤干細胞發(fā)生過程的細胞實驗模型。
　　方法: 將攜帶Piwil2-GFP標記的和空載的目的基因GFP標記的慢病毒載體分別感染原代培養(yǎng)的小兒包皮成纖維細胞，篩選建立穩(wěn)定表達Piwil2-GFP和GFP成纖維細胞系，觀察細胞形態(tài)變化及腫瘤球形成過程。體外分析細胞染色體核型，RT-PCR鑒定重編程后細胞的干細胞標記物OCT-

2、4，Sox2，Nanog，c-Myc，Klf-4及三胚層分化的相關標志物Nestin，Tubb3，Brabury, CATA-4等。裸鼠體內成瘤實驗，組織學觀察腫瘤形態(tài)，RT-PCR，免疫組織化學進一步分析分析干細胞及各胚層指標在裸鼠腫瘤中的表達。
　　結果:
　?、贌晒怙@微鏡觀察到轉染Piwil2-GFP和空載GFP成纖維細胞轉染后，兩組細胞均穩(wěn)定表達綠色熒光。48h流式細胞儀檢測轉染效率為51.2％和45.7％，繼續(xù)篩選

3、培養(yǎng)后穩(wěn)定表達率約70％，且Piwil2-GFPFB細胞體積變小，形態(tài)逐漸由長梭型變?yōu)閳A形并出現(xiàn)集落樣生長，集落可形成圓形克隆。
　?、赗T-PCR檢測Piwil2-GFP FB細胞過表達Piwil2，表達干細胞多能基因Oct-4，Sox2，Nanog，Klf-4，c-Myc及三胚層分化相關基因。
　?、廴旧w核型結果顯示Piwil2-GFP FB細胞染色體分別為67-70條的超二倍體結構，可見多倍體染色體。
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4、腫瘤球”樣克隆裸鼠體內移植2周時100％形成腫瘤，腫瘤組織學及免疫組化鑒定為來表達多種外胚層，中胚層及內胚層腫瘤標志物的惡性腫瘤，RT-PCR顯示細胞及裸鼠腫瘤表達干細胞多能基因Oct-4，Nanog，Sox2以及三胚層特征標記物。
　　結論:
　　①Piwil2基因成功轉染兒童成纖維細胞且細胞形態(tài)學發(fā)生改變，形成腫瘤球樣集落。
　?、赑iwil2重編程后的成纖維細胞具有干細胞和多潛能分化特征，致瘤性及腫瘤細胞異質性。