重編程成纖維細(xì)胞定向神經(jīng)元分化的研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦損傷、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、脊髓損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等的治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。再生醫(yī)學(xué)的目的是創(chuàng)造相同類型的健康細(xì)胞以取代病變或損傷了的組織。這其中亟待解決的兩個(gè)主要問題是:適于移植的功能細(xì)胞類型較少;外源移植可能產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。隨著使用特定外源轉(zhuǎn)錄因子將成人成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)這一技術(shù)取得成功，從

2、病人自體獲取可用于藥物篩選和移植治療的功能細(xì)胞將有可能成為現(xiàn)實(shí)。然而，對(duì)比iPS策略需將細(xì)胞命運(yùn)退回到原始狀態(tài)再分化為其他類型細(xì)胞的方法，一條新的捷徑有可能被研發(fā)出來，即直接將一種成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)換成另一種完全分化的細(xì)胞類型，而不必通過多能干細(xì)胞狀態(tài)。最近的一系列開創(chuàng)性工作表明，該方法是可行的，由三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Ngn3、Pdx1和Mafa組成的一個(gè)特定組合，可有效地在體內(nèi)直接將成年小鼠胰腺外分泌細(xì)胞重編程分化為β-細(xì)胞樣細(xì)胞。在神經(jīng)細(xì)胞重編程過

3、程中，使用神經(jīng)細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Pax6、Ngn2和Ascl1（又名Mash1），就可以將星形膠質(zhì)細(xì)胞（astroglial cell）轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元細(xì)胞。在神經(jīng)元前體細(xì)胞(neural progenitor)中表達(dá)Nurr1、Ngn2和Mash1則能夠獲得多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞(dopaminergic neuron)。因此，獲得大量可用于基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的功能性神經(jīng)元細(xì)胞具有重要的科學(xué)和社會(huì)意義。上述這些方法只是在三個(gè)胚層定向發(fā)育的內(nèi)

4、部實(shí)現(xiàn)了相互之間的細(xì)胞命運(yùn)直接轉(zhuǎn)變，如果能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)的跨系轉(zhuǎn)變，譬如將中胚層來源的細(xì)胞（如成纖維胞）直接轉(zhuǎn)變?yōu)橥馀邔觼碓吹募?xì)胞（如神經(jīng)元細(xì)胞），就能在科學(xué)上突破發(fā)育譜系直接轉(zhuǎn)變的難題，并為直接誘導(dǎo)重編程策略的應(yīng)用提供出更大的空間。將體細(xì)胞直接重編程產(chǎn)生功能細(xì)胞，可能會(huì)避免腫瘤的發(fā)生，這也將為體外建立疾病模型細(xì)胞用于藥物篩選，體內(nèi)移植治療疾病或損傷提供出一條更安全的新途徑?，F(xiàn)階段，直接誘導(dǎo)重編程策略仍處于發(fā)展的起步階段，還留有許多科學(xué)問

5、題有待解決。
　　我們的研究思路是:是否可以將手術(shù)中脫落的皮膚細(xì)胞有效地轉(zhuǎn)換成為有功能的神經(jīng)元細(xì)胞，就能更加容易地獲得某類特定疾病的特定來源功能神經(jīng)元。既往的細(xì)胞重編程研究多數(shù)只限于在體外分析所獲功能細(xì)胞的特性，而對(duì)其在體內(nèi)發(fā)揮的功能研究較少，特別是少有研究將這些重編程細(xì)胞移植到體內(nèi)后去觀察它們?cè)隗w內(nèi)的變化和行為，這就無法回答一個(gè)重要的問題，即這些細(xì)胞在體內(nèi)是否具有功能。
　　在本課題中，我們?cè)谇捌谑笃つw源性誘導(dǎo)式多潛能干細(xì)

6、胞制備的工作基礎(chǔ)上，使用三種轉(zhuǎn)錄因子將人頭皮的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有功能的人誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞(human induced neuronal cells，hiNCs)，實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)重編程的直接跨系轉(zhuǎn)變，并且將hiNCs移植到免疫缺陷小鼠的腦內(nèi)，觀察發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)元細(xì)胞能在宿主體內(nèi)存活定植。本課題研究不僅完成了從病人自身直接獲取功能神經(jīng)元細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變，也在體內(nèi)外研究了該類細(xì)胞的特征和功能，所獲結(jié)果可能會(huì)為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來一些新的啟

7、示。本課題共分以下二個(gè)部分。
　　第一部分 Ngn2、Ascl1和Sox2基因重編程人皮膚成纖維細(xì)胞為誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞的研究
　　研究目的:
　　在體外誘導(dǎo)重編程獲取人皮膚成纖維細(xì)胞來源的誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞(humaninduced neuronal cells，hiNCs)，研究這些細(xì)胞的生物學(xué)特征。
　　研究方法:
　　1.篩選與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、分化相關(guān)的誘導(dǎo)因子，構(gòu)建攜帶有轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)載體。
　　

8、2.收集培養(yǎng)頭皮成纖維細(xì)胞，載體轉(zhuǎn)染和產(chǎn)生人誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞(humaninduced neuronal cells, hiNCs)。
　　3.hiNCs的生物學(xué)特性鑒定和神經(jīng)電生理特征鑒定。
　　研究結(jié)果:
　　1.以標(biāo)準(zhǔn)皮膚細(xì)胞培養(yǎng)流程培養(yǎng)出人頭皮成纖維細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染含Ngn2、Ascl1和Sox2基因的慢病毒表達(dá)載體，獲得了具有神經(jīng)元形態(tài)和生理特征的hiNCs。
　　2.經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定和電生理檢測(cè)，

9、證明該hiNCs具有與正常神經(jīng)元相似的生物學(xué)和生理學(xué)特征。
　　研究結(jié)論:
　　使用Ngn2、Ascl1和Sox2三個(gè)基因可將人成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變成為具有神經(jīng)元細(xì)胞特征的人誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞。
　　第二部分誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞移植鼠腦內(nèi)的研究
　　研究目的:
　　檢測(cè)誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞在移植進(jìn)動(dòng)物腦內(nèi)后的生物學(xué)行為、特征和功能，為證明該類細(xì)胞在體內(nèi)具有生理功能提供證據(jù)。
　　研究方法:
　　1.流式細(xì)胞

10、術(shù)篩選hiNCs，hiNCs移植于免疫缺陷小鼠腦內(nèi)。
　　2.檢測(cè)hiNCs在宿主腦內(nèi)的生理、生化特性。
　　研究結(jié)果:
　　1.經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選，我們得到了約14.38％的PSA-NCAM+陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志。
　　2.我們將hiNCs移植8周齡雄性小鼠的腦內(nèi)，檢測(cè)到移植細(xì)胞在宿主腦內(nèi)長(zhǎng)期存活并表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的電生理特征。
　　研究結(jié)論:
　　人誘導(dǎo)性神經(jīng)元細(xì)胞(hiNCs)移植于免